Pesticidele joacă un rol esențial în abordarea deficitului alimentar global și în combaterea bolilor umane transmise prin vectori. Cu toate acestea, problema tot mai mare a rezistenței la pesticide necesită urgent descoperirea de noi compuși care vizează țintele subutilizate. Canalele potențiale ale receptorilor tranzitorii ai insectelor (TRPV) - Nanzhong (Nan) și inactive (Iav) - pot forma canale heteroloage (Nan-Iav) și se pot localiza la nivelul organelor mecanosenzoriale care mediază geotropismul, auzul și propriocepția la insecte. Unele pesticide, cum ar fi afidopirolidona (AP), vizează Nan-Iav prin mecanisme necunoscute. AP este eficient împotriva insectelor care perforează și sug (hemipterele), împiedicând hrănirea prin perturbarea funcției filamentelor. AP se poate lega doar de Nan, dar numai Nan-Iav poate interacționa cu agoniști, inclusiv nicotinamida endogenă (NAM), prezentând astfel activitate de canal. În ciuda potențialului Nan-Iav ca țintă insecticid, se cunosc puține lucruri despre asamblarea canalelor sale, situsurile de legare reglatoare și reglarea dependentă de Ca2+, ceea ce împiedică dezvoltarea ulterioară a insecticidelor. În acest studiu, s-a utilizat criomicroscopia electronică pentru a determina structura Nan-Iav la insectele Hemiptera în stare fără ligand calmodulină, precum și cu AP și NAM la limita domeniului citoplasmatic repetitiv ankirinic (ARD). În mod surprinzător, am descoperit că proteina Nan în sine poate forma un pentamer, care este stabilizat prin interacțiuni ARD mediate de AP. Acest studiu dezvăluie interacțiuni moleculare dintre insecticide și agoniști și Nan-Iav, subliniind importanța ARD în funcția și asamblarea canalului și explorând mecanismul de reglare a Ca2+.
Pe fondul schimbărilor climatice globale din ce în ce mai severe, deteriorarea securității alimentare globale este una dintre principalele provocări ale secolului XXI, cu consecințe în cascadă pentru societate.1,2Raportul Organizației Mondiale a Sănătății privind Starea Securității Alimentare și Nutriției în Lume 2023 (SOFI) estimează că aproximativ 2,33 miliarde de oameni din întreaga lume suferă de insecuritate alimentară moderată până la severă, o problemă persistentă.3,4Din păcate, se estimează că 20% până la 30% sau mai mult din randamentul culturilor se pierde anual din cauza dăunătorilor și a agenților patogeni, iar încălzirea globală se așteaptă să exacerbeze rezistența la dăunători și vulnerabilitatea culturilor.4, 5, 6, 7, 8Dezvoltarea pesticidelor este esențială nu numai pentru protejarea culturilor de dăunători și reducerea răspândirii agenților patogeni transmiși prin vectori, ci și pentru combaterea bolilor umane transmise prin vectori, cum ar fi febra dengue, malaria și boala Chagas, care sunt din ce în ce mai rezistente la pesticide.5,9,10,11
Printre principalele ținte ale insecticidelor neurotoxice, canalul heterotetrameric TRPV Nanchung (Nan)-Inactiv (Iav) reprezintă o clasă de ținte insecticide descoperite abia în ultimul deceniu, inclusiv insecticide disponibile comercial, cum ar fi imidaclopridul și piraclostrobinul.12, 13, 14Insecticidul semisintetic aphidopirolifen (AP) este un produs recent dezvoltat și comercializat, a cărui componentă principală este insecticidul activ Inscalis®, care se leagă de AP la un nivel de activitate subnanomolar.15AP prezintă o toxicitate acută scăzută pentru polenizatori, insecte benefice și alte organisme nevizate și, atunci când este utilizat conform instrucțiunilor de pe etichetă, poate reduce presiunea de rezistență la alte insecticide.16, 17, 18Nan și Iav sunt distribuite pe scară largă în rândul speciilor de insecte, sunt co-exprimate doar în neuronii receptori de întindere cordală ai antenelor și membrelor și sunt esențiali pentru auz, percepția gravitației și propriocepție.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidaclopridul și piraclostrobinul stimulează complexul Nan-Iav printr-un mecanism unic, inhibând în cele din urmă transducția semnalului proprioceptiv.13, 16, 23La insectele care perforează și sug (hemiptere), cum ar fi afidele și muștele albe, pierderea propriocepției le afectează capacitatea de hrănire, ducând în cele din urmă la moarte.13,24Interesant este că AP prezintă o afinitate mare pentru complexul Nan-Iav și o afinitate scăzută pentru Nan singur. Legarea AP de Nan-Iav induce un curent electric, dar legarea doar de Nan nu stimulează activitatea canalului. Iav în sine nu se leagă deloc de AP.16Acest lucru sugerează că Nan și Iav se pot lega pentru a forma complexe de canale Nan-Iav diferite (de exemplu, cu rapoarte stoichiometrice diferite sau aranjamente diferite în cadrul aceluiași raport stoichiometric) sau că AP se poate lega la situsuri multiple. În plus, agonistul natural nicotinamida (NAM) se leagă de Drosophila Nan-Iav cu afinitate micromolară, prezentând efecte similare cu cele ale afidelor (AP) in vitro.16,25și inhibând reproducerea și hrănirea afidelor, ducând în cele din urmă la moartea lor25,26Aceste date ridică numeroase întrebări. De exemplu, rămâne neclar cum se formează heterodimerul Nan-Iav, ce situsuri de legare sunt utilizate pentru a modula moleculele mici și cum aceste molecule mici reglează funcția canalului prin suprimarea propriocepției. În plus, rămân neclare motivele pentru care Nan în sine este inactiv și are o afinitate scăzută pentru AP, în timp ce heterodimerul Nan-Iav este activ și se leagă de AP cu o afinitate mai mare. În cele din urmă, se cunosc puține lucruri despre reglarea dependentă de Ca2+ a funcției Nan-Iav și despre modul în care aceasta este integrată în procesele de semnalizare neuronală.13,21
În acest studiu, combinând crio-microscopia electronică, electrofiziologia și tehnicile de legare a radioligandurilor, am elucidat asamblarea Nan-Iav și mecanismul de legare a acestuia la regulatorii cu molecule mici. În plus, am detectat calmodulină (CaM) legată constitutiv de Iav și pentameri Nan stabilizați cu AP. Aceste rezultate oferă informații importante despre reglarea ionilor de calciu în canale, asamblarea canalelor și factorii care determină afinitatea de legare a ligandului. Mai important, am confirmat că ARD joacă un rol central în aceste procese. Studiul nostru asupra canalelor complete ale insectelor legate de pesticidele agricole relevante27, 28, 29deschide perspective pentru dezvoltarea industriei pesticidelor, îmbunătățind eficacitatea și specificitatea pesticidelor și permițând aplicarea compușilor direcționați către TRPV la alte specii pentru a aborda securitatea alimentară globală și răspândirea bolilor transmise prin vectori.
De asemenea, am constatat că Nan-Iav este reglat de Ca2+, iar mecanismul de reglare este mediat de CaM legat constitutiv. Este important de menționat că această reglare dependentă de Ca2+ a Nav de către CaM diferă semnificativ de mecanismele de reglare ale altor canale ionice (de exemplu, canalele Na+ voltaj-dependente și canalele TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57În canalul Nav1.2, domeniul C-terminal al CaM se asociază helicoidal cu domeniul C-terminal (CTD), iar Ca2+ induce legarea domeniului său N-terminal la porțiunea distală a CTD.56În canalul TRPV5/6, domeniul C-terminal al CaM se leagă de CTH, iar Ca2+ induce extensia ascendentă a domeniului său N-terminal în por, blocând astfel permeabilitatea cationilor.53,54Propunem un model pentru funcția reglată de Ca2+ a Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). În acest model, domeniul N-terminal al CaM se leagă constitutiv de domeniul C-terminal (CTH) al Iav. În starea de repaus (concentrație scăzută de [Ca2+]), domeniul C-terminal al CaM interacționează cu Nan, stabilizând conformația ARD și promovând astfel deschiderea canalului. Legarea unui agonist/insecticid la canal induce deschiderea porilor, ducând la un influx de Ca2+. Ca2+ se leagă apoi de CaM, provocând disocierea domeniului C-terminal de ARD al Nan. Deoarece blocarea legării CaM elimină în esență efectul inhibitor al Ca2+, această disociere modulează mobilitatea ARD, provocând astfel inhibare sau desensibilizare dependentă de Ca2+. Recuperarea rapidă a curenților canalului după eluția ionilor de calciu (Fig. 4g) sugerează că acest mecanism facilitează răspunsuri rapide la semnalele neuronale mediate de Ca2+. În plus, s-a raportat că regiunea C-terminală a Iav, care rămâne puțin înțeleasă, joacă și alte roluri în direcționarea canalelor și reglarea curentă.21
În cele din urmă, studiul nostru prezintă structura de înaltă rezoluție a unui complex de canal TRP insecticid-insecticid de importanță agricolă - o descoperire necunoscută anterior. În special, am caracterizat structura și funcția canalului de insecte în celulele umane (HEK293S GnTi–), mai degrabă decât în celulele insectelor. Având în vedere rezistența crescândă la insecticide și presiunea continuă asupra securității alimentare și a agenților patogeni, munca noastră oferă informații importante care vor facilita dezvoltarea de noi insecticide în beneficiul sănătății umane și al securității alimentare globale. Studiile au arătat că insecticidele precum AP sunt eficiente împotriva unor dăunători atunci când sunt utilizate conform instrucțiunilor de pe etichetă și au o toxicitate acută scăzută pentru polenizatorii benefici, demonstrând siguranța lor pentru mediu.13,16În plus, testarea unor derivați de AP pe țânțari a arătat că aceștia își pierd în cele din urmă capacitatea de a zbura. Înțelegerea modului în care acești compuși modulatori se leagă de Nan-Iav va facilita modificarea compușilor existenți sau dezvoltarea de noi compuși pentru o utilizare mai eficientă și...preciscontrolul dăunătorilor. Studiul nostru demonstrează că interfața ARD Nan-Iav este esențială nu numai pentru reglarea activității compușilor endogeni, pesticidelor și Ca2+-CaM, ci și pentru asamblarea canalelor. Sugerăm că perturbarea asamblării heterodimerilor cu molecule mici poate fi o abordare unică și promițătoare pentru dezvoltarea inhibitorilor canalelor ionice.
Dintre cele opt gene ortologe, au fost selectate genele de lungime completă ale gândacului brun (Halyomorpha halys) Nanchung și Inactive, care prezintă o stabilitate excelentă în detergenți. Genele sintetizate au fost optimizate pentru codoni pentru exprimarea umană și clonate în vectorul pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) folosind situsurile de restricție XhoI și EcoRI. Acest lucru a asigurat că clonele se aflau în cadru cu etichetele C-terminale GFP-FLAG-10xHis și mCherry-FLAG-10xHis, care sunt scindate de proteaza HRC-3C (PPX), permițând exprimarea independentă a genelor.expresiePrimerii utilizați pentru clonarea Nanchung și Inactive în vectorul pBacMam au fost următorii:
Imaginile microscopice ale particulelor individuale au fost obținute pe un microscop electronic de transmisie (FEI) Titan Krios G2, echipat cu o cameră K3 și un filtru de energie Gatan BioQuantum. Microscopul a funcționat la 300 keV, cu o setare de energie de 20 eV, o dimensiune a pixelului eșantionului de 1,08 Å/pixel (mărire nominală de 81.000x) și un gradient de defocalizare cuprins între -0,8 și -2,2 μm. Înregistrarea video a fost efectuată la 40 de cadre pe secundă utilizând un microscop Latitude S (Gatan) cu o rată a dozei nominală de 25 e–px−1 s−1, un timp de expunere de 2,4 s și o doză totală de aproximativ 60 e–Å−2.
Corecția mișcării induse de fascicul și ponderarea dozei au fost efectuate pe film folosind MotionCor2 în RELION 4.061. Estimarea parametrilor funcției de transfer a contrastului (CTF) a fost efectuată în cryoSPARC folosind metoda de estimare CTF bazată pe patch-uri62. Microfotografiile cu o rezoluție de ajustare CTF ≥4 Å au fost excluse din analiza ulterioară. De obicei, un subset de 500-1000 de microfotografii a fost utilizat pentru selecția punctelor în cryoSPARC, urmat de mai multe runde de clasificare 2D după filtrare pentru a obține o imagine de referință clară pentru selecția particulelor bazată pe șablon. Particulele au fost apoi extrase folosind casete de delimitare de 64 de pixeli și binning de 4 ori. Au fost efectuate mai multe runde de clasificare 2D pentru a elimina categoriile de particule nedorite. Modelul 3D inițial a fost reconstruit folosind reconstrucția ab initio și rafinat folosind rafinarea neuniformă în cryoSPARC. Clasificarea 3D a fost efectuată în cryoSPARC sau RELION pe baza heterogenității ARD. Nu s-a observat o heterogenitate semnificativă a domeniilor membranare. Particulele au fost rafinate folosind metodele C1 și C2; Particulele cu o rezoluție C2 mai mare au fost considerate simetrice față de C2 și importate în RELION pentru rafinare bayesiană. Particulele au fost apoi transferate înapoi în cryoSPARC pentru rafinare finală neuniformă și locală. Rezoluția finală și numărul de particule sunt prezentate în Tabelul 1.
În procesarea pentamerilor Nan+AP, am explorat diverse metode pentru îmbunătățirea rezoluției domeniilor membranare (în special a regiunii porilor), cum ar fi scăderea semnalului și mascarea TMD. Cu toate acestea, aceste încercări au fost nereușite din cauza dezordinii potențial extreme din regiunea porilor și a eterogenității generale a TMD. Rezoluția finală a fost calculată folosind o mască generată automat de metoda de procesare neuniformă din cryoSPARC, vizând în principal regiunea ARD. Aceasta a permis obținerea unei rezoluții semnificativ mai mari decât cea a domeniilor membranare (în special a regiunii VSLD).
Modelele inițiale de novo ale formelor apo ale microorganismelor Nanchung și Inactive au fost generate inițial folosind Coot63, iar modelele microorganismelor Nan și Iav au fost generate folosind AlphaFold264 pentru a identifica regiunile cu încredere scăzută. Modelarea calmodulinei s-a bazat pe ajustări rigide ale modelelor care leagă Ca2+ și fără Ca2+ în accesările PDB 4JPZ56 și respectiv 1CFD65. Modelele au fost rafinate folosind rafinarea sferică pentru a asigura stereochimia corectă și o geometrie bună. Fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina și fosfatidilserina au fost apoi modelate ca densități lipidice bine definite, iar liganzii NAM și AP au fost plasați în densitățile corespunzătoare în joncțiunile strânse. Fișierele de constrângeri au fost generate din șirul SMILES al izoformelor folosind eLBOW în PHENIX66. În cele din urmă, modelele au fost rafinate în spațiu real în PHENIX folosind căutarea locală în grilă și minimizarea globală cu constrângeri de structură secundară. Serverul MolProbity a fost utilizat pentru rafinarea modelului și analiza structurală, iar ilustrațiile au fost realizate folosind PyMOL și UCSF Chimera X.67,68,69 Analiza aperturii a fost efectuată folosind serverul HOLE,70 iar maparea conservării secvențelor a fost realizată folosind serverul Consurf.71
Analiza statistică a fost efectuată utilizând Igor Pro 6.2, Excel Office 365 și GraphPad Prism 7.0. Toate datele cantitative sunt prezentate ca medie ± eroare standard (SEM). Testul t Student (bilateral, nepereche) a fost utilizat pentru a compara două grupuri. Analiza varianței într-o singură direcție (ANOVA), urmată de testul post-hoc Dunnett, a fost utilizată pentru a compara mai multe grupuri. *P< 0,05, **P< 0,01 și ***PValorile < 0,001 au fost considerate semnificative statistic în funcție de distribuția datelor. Valorile Kd și Ki și intervalele lor de încredere asimetrice de 95% au fost calculate folosind GraphPad Prism 10.
Pentru mai multe detalii despre metodologia studiului, vă rugăm să consultați Rezumatul Raportului Portofoliului Naturii, la care se face trimitere în acest articol.
Modelul inițial a fost construit folosind modelele de calmodulină din bazele de date PDB 4JPZ și 1CFD. Coordonatele au fost depuse în Protein Data Bank (PDB) sub numerele de acces 9NVN (Nan-Iav-CaM fără ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM legat de nicotinamidă), 9NVP (Nan-Iav-CaM legat de nicotinamidă și EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM legat de afenidolpirolină și calciu), 9NVR (Nan-Iav-CaM legat de afenidolpirolină și EDTA) și 9NVS (Nan pentamer legat de afenidolpirolină). Imaginile corespunzătoare obținute prin criomicroscopie electronică sunt depuse în baza de date pentru microscopie electronică (EMDB) sub următoarele numere de acces: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM fără ligand), EMD-49845 (complex Nan-Iav-CaM cu nicotinamidă), EMD-49846 (complex Nan-Iav-CaM cu nicotinamidă și EDTA), EMD-49847 (complex Nan-Iav-CaM cu afidopirolină și calciu), EMD-49848 (complex Nan-Iav-CaM cu afidopirolină și EDTA) și EMD-49849 (complex Nan pentamer cu afidopirolină). Datele brute pentru analiza funcțională sunt prezentate în această lucrare.
Data publicării: 28 ian. 2026