Medicamentul antihelmintic N,N-dietil-m-toluamidă (DEET) s-a raportat că inhibă AChE (acetilcolinesteraza) și are proprietăți cancerigene potențiale din cauza vascularizației excesive. În această lucrare, demonstrăm că DEET stimulează în mod specific celulele endoteliale care promovează angiogeneza, crescând astfel creșterea tumorii. DEET activează procesele celulare care duc la angiogeneză, inclusiv proliferarea, migrarea și aderența. Acest lucru este asociat cu o producție crescută de NO și cu expresia VEGF în celulele endoteliale. Reducerea la tăcere a M3 sau utilizarea inhibitorilor farmacologici M3 au abolit toate aceste efecte, sugerând că angiogeneza indusă de DEET este sensibilă la M3. Experimentele care implică semnalizarea calciului în celulele endoteliale și HEK care supraexprimă receptorii M3, precum și studiile de legare și andocare, indică faptul că DEET acționează ca un modulator alosteric al receptorilor M3. În plus, DEET inhibă AChE, crescând astfel biodisponibilitatea acetilcolinei și legarea acesteia la receptorii M3 și sporind efectele proangiogenice prin reglare alosterică.
Celulele endoteliale (EC) primare au fost izolate din aorta șoarecilor Swiss. Metoda de extracție a fost adaptată după protocolul Kobayashi26. EC murine au fost cultivate în mediu EBM-2 suplimentat cu 5% FBS inactivat termic până la a patra pasaj.
Efectul a două concentrații de DEET asupra proliferării HUVEC, U87MG sau BF16F10 a fost analizat utilizând kitul de testare a proliferării celulare CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Pe scurt, 5,103 celule per godeu au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri, lăsate să se atașeze peste noapte și apoi tratate cu DEET timp de 24 de ore. După îndepărtarea mediului de creștere, se adaugă soluție de legare a colorantului în fiecare godeu al microplăcii și se incubează celulele la 37 °C timp de 30 de minute. Nivelurile de fluorescență au fost determinate utilizând un cititor de microplăci multimod Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) echipat cu filtre de excitație de 485 nm și filtre de emisie de 530 nm.
Celulele HUVEC au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 10⁴ celule per godeu. Celulele au fost tratate cu DEET timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost evaluată utilizând un test colorimetric MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Valorile densității optice au fost obținute pe un cititor de microplăci multimod (Mithras LB940) la o lungime de undă de 570 nm.
Efectele DEET au fost studiate utilizând teste de angiogeneză in vitro. Tratamentul cu 10-8 M sau 10-5 M DEET a crescut formarea lungimii capilare în HUVEC-uri (Fig. 1a, b, bare albe). Comparativ cu grupul de control, tratamentul cu concentrații de DEET cuprinse între 10-14 și 10-5 M a arătat că lungimea capilară a atins un platou la 10-8 M DEET (Fig. suplimentară S2). Nu s-a constatat nicio diferență semnificativă în efectul proangiogenic in vitro al HUVEC-urilor tratate cu DEET în intervalul de concentrații de 10-8 M și 10-5 M.
Pentru a determina efectul DEET asupra neovascularizării, am efectuat studii de neovascularizare in vivo. După 14 zile, șoarecii injectați cu celule endoteliale precultivate cu 10-8 M sau 10-5 M DEET au prezentat o creștere semnificativă a conținutului de hemoglobină (Fig. 1c, bare albe).
În plus, neovascularizația indusă de DEET a fost studiată la șoareci purtători de xenogrefă U87MG cărora li s-a injectat zilnic (ip) DEET la o doză cunoscută pentru faptul că induce concentrații plasmatice de 10-5 M, ceea ce este normal la oamenii expuși. în 23. Tumori detectabile (adică tumori >100 mm3) au fost observate la 14 zile după injectarea celulelor U87MG la șoareci. În ziua 28, creșterea tumorii a fost semnificativ îmbunătățită la șoarecii tratați cu DEET comparativ cu șoarecii de control (Fig. 1d, pătrate). În plus, colorarea tumorilor cu CD31 a arătat că DEET a crescut semnificativ suprafața capilară, dar nu și densitatea microvaselor. (Fig. 1e-g).
Pentru a determina rolul receptorilor muscarinici în proliferarea indusă de DETA, s-a utilizat 10-8 M sau 10-5 M DETA în prezența pFHHSiD (10-7 M, un antagonist selectiv al receptorilor M3). Tratamentul HUVEC. pFHHSiD a blocat complet proprietățile proliferative ale DETA la toate concentrațiile (Tabelul 1).
În aceste condiții, am examinat și dacă DEET ar crește lungimea capilară în celulele HUVEC. În mod similar, pFHHSiD a prevenit semnificativ lungimea capilară indusă de DEET (Fig. 1a, b, bare gri). În plus, experimente similare au fost efectuate cu siRNA M3. Deși siRNA de control nu a fost eficient în promovarea formării capilarelor, reducerea la tăcere a receptorului muscarinic M3 a abolit capacitatea DEET de a crește lungimea capilară (Fig. 1a, b, bare negre).
În plus, atât vascularizația indusă in vitro de 10-8 M sau 10-5 M DEET, cât și neovascularizația in vivo au fost complet blocate de pFHHSiD (Fig. 1c, d, cercuri). Aceste rezultate indică faptul că DEET promovează angiogeneza printr-o cale sensibilă la antagoniști selectivi ai receptorilor M3 sau la siRNA M3.
AChE este ținta moleculară a DEET. Medicamente precum donepezilul, care acționează ca inhibitori ai AChE, pot stimula angiogeneza celulelor endoteliale (EC) in vitro și în modele de ischemie a membrelor posterioare la șoareci14. Am testat efectul a două concentrații de DEET asupra activității enzimei AChE în HUVEC. Concentrațiile scăzute (10-8 M) și ridicate (10-5 M) de DEET au scăzut activitatea AChE endotelială în comparație cu condițiile de control (Fig. 2).
Ambele concentrații de DEET (10⁻⁸ M și 10⁻⁵ M) au redus activitatea acetilcolinesterazei pe HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) a fost utilizat ca și control pentru inhibitorii de acetilcolinesterază. Rezultatele sunt exprimate ca procent din activitatea AChE pe HUVEC tratate cu cele două concentrații de DEET, comparativ cu celulele tratate cu substanță placebo. Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM a șase experimente independente. *p < 0,05 comparativ cu controlul (testul de comparație multiplă Kruskal-Wallis și Dunn).
Oxidul nitric (NO) este implicat în procesul angiogenic 33, prin urmare, a fost studiată producția de NO în HUVEC-urile stimulate cu DEET. Producția de NO endotelial tratat cu DEET a fost crescută în comparație cu celulele de control, dar a atins semnificație doar la o doză de 10-8 M (Fig. 3c). Pentru a determina modificările moleculare care controlează producția de NO indusă de DEET, expresia și activarea eNOS au fost analizate prin Western blot. Deși tratamentul cu DEET nu a modificat expresia eNOS, a crescut semnificativ fosforilarea eNOS la situsul său de activare (Ser-1177), scăzând în același timp situsul său inhibitor (Thr-495) în comparație cu celulele netratate în fosforilarea eNOS (Fig. 3d). În plus, raportul dintre eNOS fosforilat la situsul de activare și situsul inhibitor a fost calculat după normalizarea cantității de eNOS fosforilat la cantitatea totală de enzimă. Acest raport a fost semnificativ crescut în HUVEC-urile tratate cu fiecare concentrație de DEET în comparație cu celulele netratate (Fig. 3d).
În cele din urmă, expresia VEGF, unul dintre principalii factori proangiogenici, a fost analizată prin Western blotting. DEET a crescut semnificativ expresia VEGF, în timp ce pFHHSiD a blocat complet această expresie.
Întrucât efectele DEET sunt sensibile atât la blocarea farmacologică, cât și la reglarea negativă a receptorilor M3, am testat ipoteza că DEET ar putea amplifica semnalizarea calciului. În mod surprinzător, DEET nu a reușit să crească calciul citoplasmatic în HUVEC (datele nu sunt prezentate) și HEK/M3 (Fig. 4a, b) pentru ambele concentrații utilizate.
Data publicării: 30 decembrie 2024