Medicamentul antihelmintic N,N-dietil-m-toluamidă (DEET) sa raportat că inhibă AChE (acetilcolinesteraza) și are potențiale proprietăți cancerigene din cauza vascularizației excesive. În această lucrare, arătăm că DEET stimulează în mod specific celulele endoteliale care promovează angiogeneza, crescând astfel creșterea tumorii. DEET activează procesele celulare care conduc la angiogeneză, inclusiv proliferarea, migrarea și adeziunea. Acest lucru este asociat cu producția crescută de NO și expresia VEGF în celulele endoteliale. Reducerea la tăcere a M3 sau utilizarea inhibitorilor farmacologici M3 a eliminat toate aceste efecte, sugerând că angiogeneza indusă de DEET este sensibilă la M3. Experimentele care implică semnalizarea calciului în celulele endoteliale și HEK care supraexprimă receptorii M3, precum și studiile de legare și andocare, indică faptul că DEET acționează ca un modulator alosteric al receptorilor M3. În plus, DEET inhibă AChE, crescând astfel biodisponibilitatea acetilcolinei și legarea acesteia de receptorii M3 și sporind efectele proangiogenice prin reglarea alosterică.
CE primare au fost izolate din aorta șoarecilor elvețieni. Metoda de extracție a fost adaptată după protocolul Kobayashi 26 . EC murine au fost cultivate în mediu EBM-2 suplimentat cu 5% FBS inactivat la căldură până la a patra trecere.
Efectul a două concentrații de DEET asupra proliferării HUVEC, U87MG sau BF16F10 a fost analizat utilizând kitul CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). Pe scurt, 5,103 celule per godeu au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri, au fost lăsate să se atașeze peste noapte și apoi au fost tratate cu DEET timp de 24 de ore. După îndepărtarea mediului de creștere, adăugați soluție de legare a colorantului în fiecare godeu al microplăcii și incubați celulele la 37 °C timp de 30 de minute. Nivelurile de fluorescență au fost determinate folosind un cititor de microplăci multimod Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) echipat cu filtre de excitație de 485 nm și filtre de emisie de 530 nm.
HUVEC au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 104 celule per godeu. Celulele au fost tratate cu DEET timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară a fost evaluată utilizând un test colorimetric MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Valorile densității optice au fost obținute pe un cititor de microplăci multimod (Mithras LB940) la o lungime de undă de 570 nm.
Efectele DEET au fost studiate folosind teste de angiogeneză in vitro. Tratamentul cu 10-8 M sau 10-5 M DEET a crescut formarea lungimii capilare în HUVEC (Fig. 1a, b, bare albe). În comparație cu grupul de control, tratamentul cu concentrații DEET cuprinse între 10-14 și 10-5 M a arătat că lungimea capilară a atins un platou la 10-8 M DEET (Fig. S2 suplimentară). Nu a fost găsită nicio diferență semnificativă în efectul proangiogenic in vitro al HUVEC-urilor tratate cu DEET în intervalul de concentrații de 10-8 M și 10-5 M.
Pentru a determina efectul DEET asupra neovascularizării, am efectuat studii de neovascularizare in vivo. După 14 zile, șoarecii injectați cu celule endoteliale precultivate cu DEET 10-8 M sau 10-5 M au prezentat o creștere semnificativă a conținutului de hemoglobină (Fig. 1c, bare albe).
În plus, neovascularizarea indusă de DEET a fost studiată la șoarecii purtători de xenogrefă U87MG care au fost injectați zilnic (ip) cu DEET la o doză cunoscută pentru a induce concentrații plasmatice de 10-5 M, ceea ce este normal la oamenii expuși. în 23. Tumorile detectabile (adică tumori >100 mm3) au fost observate la 14 zile după injectarea celulelor U87MG la șoareci. În ziua 28, creșterea tumorii a fost îmbunătățită semnificativ la șoarecii tratați cu DEET în comparație cu șoarecii martor (Fig. 1d, pătrate). În plus, colorarea cu CD31 a tumorilor a arătat că DEET a crescut semnificativ aria capilară, dar nu și densitatea microvaselor. (Fig. 1e–g).
Pentru a determina rolul receptorilor muscarinici în proliferarea indusă de DETA, a fost utilizat 10-8 M sau 10-5 M DETA în prezența pFHHSiD (10-7 M, un antagonist selectiv al receptorului M3). Tratamentul HUVEC. pFHHSiD a blocat complet proprietățile proliferative ale DETA la toate concentrațiile (Tabelul 1).
În aceste condiții, am examinat, de asemenea, dacă DEET ar crește lungimea capilară în celulele HUVEC. În mod similar, pFHHSiD a prevenit în mod semnificativ lungimea capilară indusă de DEET (Fig. 1a, b, bare gri). Mai mult, au fost efectuate experimente similare cu siARN M3. Deși siRNA de control nu a fost eficient în promovarea formării capilare, tăcere a receptorului muscarinic M3 a desființat capacitatea DEET de a crește lungimea capilară (Fig. 1a, b, bare negre).
În plus, atât vascularizarea indusă de DEET 10-8 M sau 10-5 M in vitro, cât și neovascularizarea in vivo au fost complet blocate de pFHHSiD (Fig. 1c, d, cercuri). Aceste rezultate indică faptul că DEET promovează angiogeneza printr-o cale sensibilă la antagoniştii selectivi ai receptorilor M3 sau siARN M3.
AChE este ținta moleculară a DEET. Medicamente precum donepezilul, care acționează ca inhibitori AChE, pot stimula angiogeneza EC in vitro și în modelele de ischemie a membrelor posterioare de șoarece14. Am testat efectul a două concentrații de DEET asupra activității enzimei AChE în HUVEC. Concentrațiile scăzute (10-8 M) și mari (10-5 M) de DEET au scăzut activitatea AChE endotelială în comparație cu condițiile de control (Fig. 2).
Ambele concentrații de DEET (10-8 M și 10-5 M) au redus activitatea acetilcolinesterazei pe HUVEC. BW284c51 (10-5 M) a fost utilizat ca martor pentru inhibitorii de acetilcolinesterază. Rezultatele sunt exprimate ca procent din activitatea AChE pe HUVEC tratat cu cele două concentrații de DEET în comparație cu celulele tratate cu vehicul. Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM a șase experimente independente. *p < 0,05 comparativ cu martor (testul de comparație multiplă Kruskal-Wallis și Dunn).
Oxidul nitric (NO) este implicat în procesul angiogenic 33, prin urmare, a fost studiată producția de NO în HUVEC stimulate de DEET. Producția de NO endotelială tratată cu DEET a fost crescută în comparație cu celulele martor, dar a atins semnificație doar la o doză de 10-8 M (Fig. 3c). Pentru a determina modificările moleculare care controlează producția de NO indusă de DEET, expresia și activarea eNOS au fost analizate prin Western blot. Deși tratamentul cu DEET nu a modificat expresia eNOS, a crescut semnificativ fosforilarea eNOS la locul său de activare (Ser-1177), în timp ce a scăzut locul său inhibitor (Thr-495) în comparație cu celulele netratate în fosforilarea eNOS (Fig. 3d). Mai mult, raportul dintre eNOS fosforilat la locul de activare și locul inhibitor a fost calculat după normalizarea cantității de eNOS fosforilat la cantitatea totală de enzimă. Acest raport a fost crescut semnificativ în HUVEC-urile tratate cu fiecare concentrație de DEET în comparație cu celulele netratate (Fig. 3d).
În cele din urmă, expresia VEGF, unul dintre principalii factori proangiogenici, a fost analizată prin Western blot. DEET a crescut semnificativ expresia VEGF, în timp ce pFHHSiD a blocat complet această expresie.
Deoarece efectele DEET sunt sensibile atât la blocarea farmacologică, cât și la reglarea în jos a receptorilor M3, am testat ipoteza că DEET ar putea îmbunătăți semnalizarea calciului. În mod surprinzător, DEET nu a reușit să crească calciul citoplasmatic în HUVEC (datele nu sunt afișate) și HEK/M3 (Fig. 4a, b) pentru ambele concentrații utilizate.
Ora postării: 30-dec-2024