În acest studiu, efectele stimulative ale tratamentului combinat alregulatori de creștere a plantelor(2,4-D și kinetină) și nanoparticule de oxid de fier (Fe₃O₄-NP) asupra morfogenezei in vitro și producției de metaboliți secundari la *Hypericum perforatum* L. au fost investigate. Tratamentul optimizat [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetină (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] a îmbunătățit semnificativ parametrii de creștere a plantelor: înălțimea plantei a crescut cu 59,6%, lungimea rădăcinii cu 114,0%, numărul de muguri cu 180,0% și greutatea proaspătă a calusului cu 198,3% comparativ cu grupul de control. Acest tratament combinat a îmbunătățit, de asemenea, eficiența regenerării (50,85%) și a crescut conținutul de hipericină cu 66,6%. Analiza GC-MS a relevat conținuturi ridicate de hiperozidă, β-patolină și alcool cetilic, reprezentând 93,36% din suprafața totală a vârfului, în timp ce conținutul de fenoli și flavonoide totale a crescut cu până la 80,1%. Aceste rezultate indică faptul că regulatorii de creștere a plantelor (PGR) și nanoparticulele de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) exercită un efect sinergic prin stimularea organogenezei și acumulării de compuși bioactivi, ceea ce reprezintă o strategie promițătoare pentru îmbunătățirea biotehnologică a plantelor medicinale.
Sunătoarea (Hypericum perforatum L.), cunoscută și sub numele de sunătoare, este o plantă erbacee perenă din familia Hypericaceae, cu valoare economică.[1] Componentele sale bioactive potențiale includ taninuri naturale, xantone, floroglucinol, naftalindionă (hiperină și pseudohiperină), flavonoide, acizi fenolici și uleiuri esențiale.[2,3,4] Sunătoarea poate fi propagată prin metode tradiționale; cu toate acestea, sezonalitatea metodelor tradiționale, germinarea scăzută a semințelor și susceptibilitatea la boli îi limitează potențialul pentru cultivare la scară largă și formarea continuă de metaboliți secundari.[1,5,6]
Astfel, cultura de țesuturi in vitro este considerată o metodă eficientă pentru propagarea rapidă a plantelor, conservarea resurselor de germoplasmă și creșterea randamentului compușilor medicinali [7, 8]. Regulatorii de creștere a plantelor (PGR) joacă un rol crucial în reglarea morfogenezei și sunt necesari pentru cultivarea in vitro a calusului și a organismelor întregi. Optimizarea concentrațiilor și combinațiilor acestora este crucială pentru finalizarea cu succes a acestor procese de dezvoltare [9]. Prin urmare, înțelegerea compoziției și concentrației adecvate a regulatorilor este importantă pentru îmbunătățirea capacității de creștere și regenerare a sunătoarei (H. perforatum) [10].
Nanoparticulele de oxid de fier (Fe₃O₄) sunt o clasă de nanoparticule care au fost sau sunt în curs de dezvoltare pentru cultura de țesuturi. Fe₃O₄ are proprietăți magnetice semnificative, o bună biocompatibilitate și capacitatea de a promova creșterea plantelor și de a reduce stresul din mediu, așa că a atras o atenție considerabilă în proiectele de culturi de țesuturi. Aplicațiile potențiale ale acestor nanoparticule pot include optimizarea culturii in vitro pentru a promova diviziunea celulară, a îmbunătăți absorbția nutrienților și a activa enzimele antioxidante [11].
Deși nanoparticulele au demonstrat efecte promotoare bune asupra creșterii plantelor, studiile privind aplicarea combinată a nanoparticulelor de Fe₃O₄ și a regulatorilor de creștere optimizați ai plantelor la *H. perforatum* rămân rare. Pentru a umple această lacună în cunoștințe, acest studiu a evaluat efectele efectelor lor combinate asupra morfogenezei in vitro și producției de metaboliți secundari pentru a oferi noi perspective asupra îmbunătățirii caracteristicilor plantelor medicinale. Prin urmare, acest studiu are două obiective: (1) optimizarea concentrației de regulatori de creștere a plantelor pentru a promova eficient formarea calusului, regenerarea lăstarilor și înrădăcinarea in vitro; și (2) evaluarea efectelor nanoparticulelor de Fe₃O₄ asupra parametrilor de creștere in vitro. Planurile viitoare includ evaluarea ratei de supraviețuire a plantelor regenerate în timpul aclimatizării (in vitro). Se așteaptă ca rezultatele acestui studiu să îmbunătățească semnificativ eficiența micropropagarii la *H. perforatum*, contribuind astfel la utilizarea durabilă și aplicațiile biotehnologice ale acestei importante plante medicinale.
În acest studiu, am obținut explante de frunze de la plante anuale de sunătoare (plante mamă) cultivate în câmp. Aceste explante au fost utilizate pentru a optimiza condițiile de cultură in vitro. Înainte de cultivare, frunzele au fost clătite bine sub jet de apă distilată timp de câteva minute. Suprafețele explantelor au fost apoi dezinfectate prin imersare în etanol 70% timp de 30 de secunde, urmată de imersare într-o soluție de hipoclorit de sodiu (NaOCl) 1,5% conținând câteva picături de Tween 20 timp de 10 minute. În final, explantele au fost clătite de trei ori cu apă distilată sterilă înainte de a fi transferate în următorul mediu de cultură.
Pe parcursul următoarelor patru săptămâni, au fost măsurați parametrii de regenerare a lăstarilor, inclusiv rata de regenerare, numărul de lăstari per explant și lungimea lăstarilor. Când lăstarii regenerați au atins o lungime de cel puțin 2 cm, aceștia au fost transferați într-un mediu de înrădăcinare constând din mediu MS la jumătate din concentrație, acid indolbutiric (IBA) 0,5 mg/L și gumă de guar 0,3%. Cultura de înrădăcinare a continuat timp de trei săptămâni, timp în care au fost măsurate rata de înrădăcinare, numărul de rădăcini și lungimea rădăcinilor. Fiecare tratament a fost repetat de trei ori, cu 10 explante cultivate per replicat, rezultând aproximativ 30 de explante per tratament.
Înălțimea plantei a fost măsurată în centimetri (cm) folosind o riglă, de la baza plantei până la vârful celei mai înalte frunze. Lungimea rădăcinii a fost măsurată în milimetri (mm) imediat după îndepărtarea cu grijă a răsadurilor și a mediului de creștere. Numărul de muguri per explant a fost numărat direct pe fiecare plantă. Numărul de pete negre de pe frunze, cunoscute sub numele de noduli, a fost măsurat vizual. Se crede că acești noduli negri sunt glande care conțin hipericină sau pete oxidative și sunt utilizați ca indicator fiziologic al răspunsului plantei la tratament. După îndepărtarea întregului mediu de creștere, greutatea proaspătă a răsadurilor a fost măsurată folosind un cântar electronic cu o precizie de miligrame (mg).
Metoda de calculare a ratei de formare a calusului este următoarea: după cultivarea explantelor într-un mediu care conține diverși regulatori de creștere (kinaze, 2,4-D și Fe3O4) timp de patru săptămâni, se numără numărul de explante capabile să formeze calus. Formula de calculare a ratei de formare a calusului este următoarea:
Fiecare tratament a fost repetat de trei ori, cu cel puțin 10 explante examinate la fiecare repetare.
Rata de regenerare reflectă proporția de țesut calus care finalizează cu succes procesul de diferențiere a mugurilor după etapa de formare a calusului. Acest indicator demonstrează capacitatea țesutului calus de a se transforma în țesut diferențiat și de a crește în noi organe ale plantei.
Coeficientul de înrădăcinare este raportul dintre numărul de ramuri capabile să prindă rădăcini și numărul total de ramuri. Acest indicator reflectă succesul etapei de înrădăcinare, care este crucială în micropropagare și propagarea plantelor, deoarece o înrădăcinare bună ajută răsadurile să supraviețuiască mai bine în condiții de creștere.
Compușii de hipericină au fost extrași cu metanol 90%. Cincizeci de mg de material vegetal uscat au fost adăugați la 1 ml de metanol și sonicat timp de 20 de minute la 30 kHz într-un aparat de curățare cu ultrasunete (model A5120-3YJ) la temperatura camerei, în întuneric. După sonicare, proba a fost centrifugată la 6000 rpm timp de 15 minute. Supernatantul a fost colectat, iar absorbanța hipericinei a fost măsurată la 592 nm folosind un spectrofotometru Plus-3000 S, conform metodei descrise de Conceiçao și colab. [14].
Majoritatea tratamentelor cu regulatori de creștere a plantelor (PGR) și nanoparticule de oxid de fier (Fe₃O₄-NP) nu au indus formarea de noduli negri pe frunzele regenerate ale lăstarilor. Nu s-au observat noduli în niciunul dintre tratamentele cu 0,5 sau 1 mg/L 2,4-D, 0,5 sau 1 mg/L kinetină sau 1, 2 sau 4 mg/L nanoparticule de oxid de fier. Câteva combinații au arătat o ușoară creștere a dezvoltării nodulilor (dar nu semnificativă statistic) la concentrații mai mari de kinetină și/sau nanoparticule de oxid de fier, cum ar fi combinația de 2,4-D (0,5–2 mg/L) cu kinetină (1–1,5 mg/L) și nanoparticule de oxid de fier (2–4 mg/L). Aceste rezultate sunt prezentate în Figura 2. Nodulii negri reprezintă glande bogate în hipericină, atât naturale, cât și benefice. În acest studiu, nodulii negri au fost asociați în principal cu rumenirea țesuturilor, indicând un mediu favorabil pentru acumularea de hipericină. Tratamentul cu nanoparticule de 2,4-D, kinetină și Fe₃O₄ a promovat creșterea calusului, a redus brunificarea și a crescut conținutul de clorofilă, sugerând o funcție metabolică îmbunătățită și o potențială reducere a daunelor oxidative [37]. Acest studiu a evaluat efectele kinetinei în combinație cu nanoparticule de 2,4-D și Fe₃O₄ asupra creșterii și dezvoltării calusului de sunătoare (Fig. 3a-g). Studiile anterioare au arătat că nanoparticulele de Fe₃O₄ au activități antifungice și antimicrobiene [38, 39] și, atunci când sunt utilizate în combinație cu regulatori de creștere a plantelor, pot stimula mecanismele de apărare ale plantelor și pot reduce indicii de stres celular [18]. Deși biosinteza metaboliților secundari este reglată genetic, randamentul lor real depinde în mare măsură de condițiile de mediu. Modificările metabolice și morfologice pot influența nivelurile metaboliților secundari prin reglarea expresiei genelor specifice plantelor și prin răspunsul la factorii de mediu. În plus, inductorii pot declanșa activarea unor noi gene, care, la rândul lor, stimulează activitatea enzimatică, activând în cele din urmă multiple căi biosintetice și ducând la formarea de metaboliți secundari. În plus, un alt studiu a arătat că reducerea umbririi crește expunerea la lumina soarelui, crescând astfel temperaturile din timpul zilei în habitatul natural al *Hypericum perforatum*, ceea ce contribuie, de asemenea, la creșterea producției de hipericină. Pe baza acestor date, acest studiu a investigat rolul nanoparticulelor de fier ca potențiali inductori în cultura de țesuturi. Rezultatele au arătat că aceste nanoparticule pot activa gene implicate în biosinteza hesperidinei prin stimulare enzimatică, ducând la o acumulare crescută a acestui compus (Fig. 2). Prin urmare, în comparație cu plantele care cresc în condiții naturale, se poate argumenta că producția de astfel de compuși in vivo poate fi, de asemenea, îmbunătățită atunci când stresul moderat este combinat cu activarea genelor implicate în biosinteza metaboliților secundari. Tratamentele combinate au, în general, un efect pozitiv asupra ratei de regenerare, dar, în unele cazuri, acest efect este slăbit. În mod special, tratamentul cu 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinază și diferite concentrații ar putea crește independent și semnificativ rata de regenerare cu 50,85% comparativ cu grupul de control (Fig. 4c). Aceste rezultate sugerează că anumite combinații de nanohormoni pot acționa sinergic pentru a promova creșterea plantelor și producția de metaboliți, ceea ce are o mare importanță pentru cultura țesuturilor plantelor medicinale. Palmer și Keller [50] au arătat că tratamentul cu 2,4-D ar putea induce independent formarea de calus în St. perforatum, în timp ce adăugarea de kinază a îmbunătățit semnificativ formarea și regenerarea calusului. Acest efect s-a datorat îmbunătățirii echilibrului hormonal și stimulării diviziunii celulare. Bal și colab. [51] au descoperit că tratamentul cu Fe₃O₄-NP ar putea spori independent funcția enzimelor antioxidante, promovând astfel creșterea rădăcinilor în St. perforatum. Mediile de cultură care conțin nanoparticule de Fe₃O₄ la concentrații de 0,5 mg/L, 1 mg/L și 1,5 mg/L au îmbunătățit rata de regenerare a plantelor de in [52]. Utilizarea kinetinei, 2,4-diclorobenzotiazolinonei și nanoparticulelor de Fe₃O₄ a îmbunătățit semnificativ ratele de formare a calusului și a rădăcinilor, însă trebuie luate în considerare potențialele efecte secundare ale utilizării acestor hormoni pentru regenerarea in vitro. De exemplu, utilizarea pe termen lung sau în concentrații mari a 2,4-diclorobenzotiazolinonei sau kinetinei poate duce la variații clonale somatice, stres oxidativ, morfologie anormală a calusului sau vitrificare. Prin urmare, o rată ridicată de regenerare nu prezice neapărat stabilitatea genetică. Toate plantele regenerate ar trebui evaluate folosind markeri moleculari (de exemplu, RAPD, ISSR, AFLP) sau analize citogenetice pentru a determina omogenitatea și similaritatea lor cu plantele in vivo [53,54,55].
Acest studiu a demonstrat pentru prima dată că utilizarea combinată a regulatorilor de creștere a plantelor (2,4-D și kinetină) cu nanoparticule de Fe₃O₄ poate îmbunătăți morfogeneza și acumularea metaboliților bioactivi cheie (inclusiv hipericina și hiperozida) în *Hypericum perforatum*. Regimul de tratament optimizat (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetină + 4 mg/L Fe₃O₄-NP-uri) nu numai că a maximizat formarea calusului, organogeneza și randamentul metaboliților secundari, dar a demonstrat și un efect de inducere ușoară, îmbunătățind potențial toleranța la stres și valoarea medicinală a plantei. Combinația dintre nanotehnologie și cultura țesuturilor vegetale oferă o platformă durabilă și eficientă pentru producția in vitro la scară largă de compuși medicinali. Aceste rezultate deschid calea pentru aplicații industriale și cercetări viitoare privind mecanismele moleculare, optimizarea dozajului și precizia genetică, legând astfel cercetarea fundamentală privind plantele medicinale cu biotehnologia practică.
Data publicării: 12 decembrie 2025