Creșterea meristemului apical al lăstarului (SAM) este esențială pentru arhitectura tulpinii. Hormoni vegetaligibereline(GAs) joacă roluri cheie în coordonarea creșterii plantelor, dar rolul lor în SAM rămâne puțin înțeles. Aici, am dezvoltat un biosenzor rațiometric al semnalizării GA prin proiectarea proteinei DELLA pentru a suprima funcția sa de reglare esențială în răspunsul transcripțional GA, păstrând în același timp degradarea sa la recunoașterea GA. Demonstrăm că acest biosenzor bazat pe degradare înregistrează cu precizie modificările nivelurilor GA și ale detectării celulare în timpul dezvoltării. Am folosit acest biosenzor pentru a cartografia activitatea de semnalizare GA în SAM. Arătăm că semnalele GA ridicate sunt prezente predominant în celulele situate între primordiile organelor, care sunt precursori ai celulelor internodale. Folosind abordări de tip câștig și pierdere a funcției, demonstrăm în continuare că GA reglează orientarea planului de diviziune celulară, stabilind organizarea celulară canonică a internodurilor, promovând astfel specificarea internodalului în SAM.
Meristemul apical al lăstarului (SAM), situat la vârful lăstarului, conține o nișă de celule stem a căror activitate generează organe laterale și noduri ale stemului într-o manieră modulară și iterativă pe tot parcursul vieții plantei. Fiecare dintre aceste unități repetitive, sau noduri ale plantei, include internoduri și organe laterale la noduri, precum și meristeme axilare la axilele frunzelor1. Creșterea și organizarea nodurilor plantei se schimbă în timpul dezvoltării. La Arabidopsis, creșterea internodală este suprimată în timpul stadiului vegetativ, iar meristemele axilare rămân latente la axilele frunzelor de rozetă. În timpul tranziției la faza florală, SAM devine meristemul inflorescenței, generând internoduri alungite și muguri axilari, ramurițe la axilele frunzelor cauline și, mai târziu, flori fără frunze2. Deși am făcut progrese semnificative în înțelegerea mecanismelor care controlează inițierea frunzelor, florilor și ramurilor, se știe relativ puțin despre modul în care apar internodurile.
Înțelegerea distribuției spatiotemporale a GA va ajuta la o mai bună înțelegere a funcțiilor acestor hormoni în diferite țesuturi și în diferite stadii de dezvoltare. Vizualizarea degradării fuziunii RGA-GFP exprimată sub acțiunea propriului promotor oferă informații importante despre reglarea nivelurilor totale de GA în rădăcini15,16. Cu toate acestea, expresia RGA variază în funcție de țesuturi17 și este reglată de GA18. Astfel, expresia diferențială a promotorului RGA poate duce la modelul de fluorescență observat cu RGA-GFP și, prin urmare, această metodă nu este cantitativă. Mai recent, GA19,20 marcat cu fluoresceină bioactivă (Fl) a relevat acumularea de GA în endocortexul rădăcinii și reglarea nivelurilor sale celulare prin transportul de GA. Recent, senzorul GA FRET nlsGPS1 a arătat că nivelurile de GA se corelează cu alungirea celulară în rădăcini, filamente și hipocotile crescute la culoare21. Cu toate acestea, așa cum am văzut, concentrația de GA nu este singurul parametru care controlează activitatea de semnalizare a GA, deoarece depinde de procese complexe de detectare. Aici, bazându-ne pe înțelegerea noastră asupra căilor de semnalizare DELLA și GA, raportăm dezvoltarea și caracterizarea unui biosenzor ratiometric bazat pe degradare pentru semnalizarea GA. Pentru a dezvolta acest biosenzor cantitativ, am utilizat o RGA mutantă sensibilă la GA, care a fost fuzionată cu o proteină fluorescentă și exprimată ubicuitar în țesuturi, precum și o proteină fluorescentă insensibilă la GA. Arătăm că fuziunile proteinelor RGA mutante nu interferează cu semnalizarea GA endogenă atunci când este exprimată ubicuitar și că acest biosenzor poate cuantifica activitatea de semnalizare rezultată atât din intrarea GA, cât și din procesarea semnalului GA de către aparatul de detectare cu o rezoluție spatiotemporală ridicată. Am folosit acest biosenzor pentru a cartografia distribuția spatiotemporală a activității de semnalizare GA și pentru a cuantifica modul în care GA reglează comportamentul celular în epiderma SAM. Demonstrăm că GA reglează orientarea planului de diviziune al celulelor SAM situate între primordiile organelor, definind astfel organizarea celulară canonică a internodului.
În cele din urmă, ne-am întrebat dacă qmRGA poate raporta modificări ale nivelurilor endogene de acid gàstric (GA) utilizând hipocotile în creștere. Anterior, am arătat că nitratul stimulează creșterea prin creșterea sintezei de GA și, implicit, a degradării DELLA34. În consecință, am observat că lungimea hipocotilului în răsadurile pUBQ10::qmRGA cultivate în condiții de aport abundent de nitrați (10 mM NO3−) a fost semnificativ mai mare decât cea a răsadurilor cultivate în condiții de deficit de nitrați (Fig. suplimentară 6a). În concordanță cu răspunsul la creștere, semnalele GA au fost mai mari în hipocotilele răsadurilor cultivate în condiții de 10 mM NO3− decât în răsadurile cultivate în absența nitraților (Fig. suplimentară 6b, c). Astfel, qmRGA permite, de asemenea, monitorizarea modificărilor semnalizării GA induse de modificările endogene ale concentrației de GA.
Pentru a înțelege dacă activitatea de semnalizare GA detectată de qmRGA depinde de concentrația GA și de percepția GA, așa cum era de așteptat pe baza designului senzorului, am analizat expresia celor trei receptori GID1 în țesuturile vegetative și reproductive. La răsaduri, linia reporter GID1-GUS a arătat că GID1a și c au fost exprimați la niveluri ridicate în cotiledoane (Fig. 3a-c). În plus, toți cei trei receptori au fost exprimați în frunze, primordiile rădăcinilor laterale, vârfurile rădăcinilor (cu excepția căștii radiculare a GID1b) și sistemul vascular (Fig. 3a-c). În SAM-ul inflorescenței, am detectat semnale GUS doar pentru GID1b și 1c (Fig. suplimentară 7a-c). Hibridizarea in situ a confirmat aceste modele de expresie și a demonstrat în continuare că GID1c a fost exprimat uniform la niveluri scăzute în SAM, în timp ce GID1b a prezentat o expresie mai mare la periferia SAM (Fig. suplimentară 7d-l). Fuziunea translațională pGID1b::2xmTQ2-GID1b a relevat, de asemenea, o gamă gradată de expresie GID1b, de la expresie scăzută sau deloc în centrul SAM până la expresie ridicată la marginile organelor (Fig. suplimentară 7m). Astfel, receptorii GID1 nu sunt distribuiți uniform în și în interiorul țesuturilor. În experimentele ulterioare, am observat, de asemenea, că supraexprimarea GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) a crescut sensibilitatea qmRGA în hipocotile la aplicarea externă de GA (Fig. 3d, e). În schimb, fluorescența măsurată prin qd17mRGA în hipocotil a fost insensibilă la tratamentul cu GA3 (Fig. 3f, g). Pentru ambele teste, răsadurile au fost tratate cu concentrații mari de GA (100 μM GA3) pentru a evalua comportamentul rapid al senzorului, unde capacitatea de a se lega de receptorul GID1 a fost îmbunătățită sau pierdută. Împreună, aceste rezultate confirmă faptul că biosenzorul qmRGA îndeplinește o funcție combinată de senzor GA și GA și sugerează că expresia diferențială a receptorului GID1 poate modula semnificativ emisivitatea senzorului.
Până în prezent, distribuția semnalelor GA în SAM rămâne neclară. Prin urmare, am utilizat plante care exprimă qmRGA și reporterul de celule stem pCLV3::mCherry-NLS35 pentru a calcula hărți cantitative de înaltă rezoluție ale activității de semnalizare GA, concentrându-ne pe stratul L1 (epidermă; Fig. 4a, b, vezi Metode și Metode Suplimentare), deoarece L1 joacă un rol cheie în controlul creșterii SAM36. Aici, expresia pCLV3::mCherry-NLS a furnizat un punct de referință geometric fix pentru analiza distribuției spatiotemporale a activității de semnalizare GA37. Deși GA este considerat esențial pentru dezvoltarea laterală a organelor4, am observat că semnalele GA au fost scăzute în primordiul floral (P) începând din stadiul P3 (Fig. 4a, b), în timp ce primordiile tinere P1 și P2 au avut o activitate moderată similară cu cea din regiunea centrală (Fig. 4a, b). O activitate de semnalizare GA mai mare a fost detectată la limitele primordiilor organelor, începând de la P1/P2 (pe laturile limitei) și atingând vârful la P4, precum și în toate celulele regiunii periferice situate între primordii (Fig. 4a, b și Fig. suplimentară 8a, b). Această activitate de semnalizare GA mai mare a fost observată nu numai în epidermă, ci și în straturile L2 și L3 superioare (Fig. suplimentară 8b). Modelul semnalelor GA detectate în SAM folosind qmRGA a rămas, de asemenea, neschimbat în timp (Fig. suplimentară 8c-f, k). Deși constructul qd17mRGA a fost reglat sistematic în jos în SAM plantelor T3 din cinci linii independente pe care le-am caracterizat în detaliu, am putut analiza modelele de fluorescență obținute cu constructul pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. suplimentară 8g-j, l). În această linie de control, au fost detectate doar modificări minore ale raportului de fluorescență în SAM, dar în centrul SAM am observat o scădere clară și neașteptată a VENUS asociată cu TagBFP. Acest lucru confirmă faptul că modelul de semnalizare observat de qmRGA reflectă degradarea dependentă de GA a mRGA-VENUS, dar demonstrează și că qmRGA poate supraestima activitatea de semnalizare GA în centrul meristemului. În concluzie, rezultatele noastre dezvăluie un model de semnalizare GA care reflectă în primul rând distribuția primordiilor. Această distribuție a regiunii interprimordiale (IPR) se datorează stabilirii treptate a unei activități ridicate de semnalizare GA între primordiul în curs de dezvoltare și regiunea centrală, în timp ce, în același timp, activitatea de semnalizare GA în primordiu scade (Fig. 4c, d).
Distribuția receptorilor GID1b și GID1c (vezi mai sus) sugerează că expresia diferențială a receptorilor GA ajută la modelarea modelului activității de semnalizare GA în SAM. Ne-am întrebat dacă ar putea fi implicată acumularea diferențială de GA. Pentru a investiga această posibilitate, am utilizat senzorul nlsGPS1 GA FRET21. O frecvență crescută de activare a fost detectată în SAM-ul nlsGPS1 tratat cu 10 μM GA4+7 timp de 100 de minute (Fig. suplimentară 9a-e), indicând faptul că nlsGPS1 răspunde la modificările concentrației de GA în SAM, așa cum se întâmplă și în rădăcini21. Distribuția spațială a frecvenței de activare nlsGPS1 a relevat niveluri relativ scăzute de GA în straturile exterioare ale SAM, dar a arătat că acestea erau ridicate în centru și la marginile SAM (Fig. 4e și Fig. suplimentară 9a,c). Acest lucru sugerează că GA este, de asemenea, distribuit în SAM cu un model spațial comparabil cu cel relevat de qmRGA. Ca abordare complementară, am tratat și SAM cu GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) sau Fl singur ca și control negativ. Semnalul Fl a fost distribuit în întregul SAM, inclusiv în regiunea centrală și primordiu, deși la o intensitate mai mică (Fig. 4j și Fig. suplimentară 10d). În schimb, toate cele trei GA-Fl s-au acumulat specific în limitele primordiului și în grade diferite în restul IPR, GA7-Fl acumulându-se în cel mai mare domeniu din IPR (Fig. 4k și Fig. suplimentare 10a,b). Cuantificarea intensității fluorescenței a relevat că raportul dintre intensitatea IPR și cea non-IPR a fost mai mare în SAM tratat cu GA-Fl comparativ cu SAM tratat cu Fl (Fig. 4l și Fig. suplimentară 10c). Împreună, aceste rezultate sugerează că GA este prezent la concentrații mai mari în celulele IPR care sunt situate cel mai aproape de limita organului. Acest lucru sugerează că modelul activității de semnalizare GA în SAM rezultă atât din exprimarea diferențială a receptorilor GA, cât și din acumularea diferențială de GA în celulele IPR din apropierea marginilor organelor. Astfel, analiza noastră a relevat un model spatiotemporal neașteptat al semnalizării GA, cu o activitate mai scăzută în centrul și primordiumul SAM și o activitate mai mare în IPR în regiunea periferică.
Pentru a înțelege rolul activității diferențiale de semnalizare GA în SAM, am analizat corelația dintre activitatea de semnalizare GA, expansiunea celulară și diviziunea celulară utilizând imagistica time-lapse în timp real a SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Având în vedere rolul GA în reglarea creșterii, era de așteptat o corelație pozitivă cu parametrii de expansiune celulară. Prin urmare, am comparat mai întâi hărțile activității de semnalizare GA cu hărțile ratei de creștere a suprafeței celulare (ca indicator al intensității expansiunii celulare pentru o anumită celulă și pentru celulele fiice la diviziune) și cu hărțile anizotropiei de creștere, care măsoară direcționalitatea expansiunii celulare (utilizată și aici pentru o anumită celulă și pentru celulele fiice la diviziune; Fig. 5a,b, vezi Metode și Metode Suplimentare). Hărțile noastre ale ratei de creștere a suprafeței celulare SAM sunt în concordanță cu observațiile anterioare38,39, cu rate de creștere minime la margine și rate de creștere maxime în florile în curs de dezvoltare (Fig. 5a). Analiza componentelor principale (PCA) a arătat că activitatea de semnalizare GA a fost corelată negativ cu intensitatea creșterii suprafeței celulare (Figura 5c). De asemenea, am arătat că principalele axe de variație, inclusiv semnalizarea GA și intensitatea creșterii, au fost ortogonale față de direcția determinată de expresia ridicată a CLV3, confirmând excluderea celulelor din centrul SAM în analizele rămase. Analiza de corelație Spearman a confirmat rezultatele PCA (Figura 5d), indicând faptul că semnalele GA mai mari în IPR nu au dus la o expansiune celulară mai mare. Cu toate acestea, analiza de corelație a relevat o ușoară corelație pozitivă între activitatea de semnalizare GA și anizotropia creșterii (Figura 5c, d), sugerând că o semnalizare GA mai mare în IPR influențează direcția creșterii celulare și, eventual, poziția planului de diviziune celulară.
a, b Hărți termice ale creșterii medii a suprafeței (a) și anizotropiei de creștere (b) în SAM, mediate pe șapte plante independente (utilizate ca indicatori pentru intensitatea și respectiv direcția expansiunii celulare). c Analiza PCA a inclus următoarele variabile: semnalul GA, intensitatea creșterii la suprafață, anizotropia creșterii la suprafață și expresia CLV3. Componenta PCA 1 a fost în principal corelată negativ cu intensitatea creșterii la suprafață și corelată pozitiv cu semnalul GA. Componenta PCA 2 a fost în principal corelată pozitiv cu anizotropia creșterii la suprafață și corelată negativ cu expresia CLV3. Procentajele reprezintă variația explicată de fiecare componentă. d Analiza corelației Spearman între semnalul GA, intensitatea creșterii la suprafață și anizotropia creșterii la suprafață la scară tisulară, excluzând CZ. Numărul din dreapta este valoarea rho Spearman între două variabile. Asteriscurile indică cazurile în care corelația/corelația negativă este foarte semnificativă. e Vizualizare 3D a celulelor Col-0 SAM L1 prin microscopie confocală. Noii pereți celulari formați în SAM (dar nu și în primordiu) la 10 ore sunt colorați în funcție de valorile unghiului lor. Bara de culori este afișată în colțul din dreapta jos. Inserția prezintă imaginea 3D corespunzătoare la 0 h. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. f Diagramele tip box prezintă ratele de diviziune celulară în SAM Col-0 IPR și non-IPR (n = 10 plante independente). Linia centrală arată mediana, iar limitele casetei indică percentilele 25 și 75. Mustățile indică valorile minime și maxime determinate cu software-ul R. Valorile P au fost obținute cu testul t bilateral Welch. g, h Diagramă schematică care arată (g) cum se măsoară unghiul noului perete celular (magenta) față de direcția radială din centrul SAM (linie punctată albă) (sunt luate în considerare doar valorile unghiului ascuțit, adică 0–90°) și (h) direcțiile circumferențiale/laterale și radiale din cadrul meristemului. i Histograme de frecvență ale orientării planului de diviziune celulară pe SAM (albastru închis), IPR (albastru mediu) și respectiv non-IPR (albastru deschis). Valorile p au fost obținute printr-un test Kolmogorov-Smirnov bilateral. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. j Histograme de frecvență ale orientării planului de diviziune celulară a IPR în jurul P3 (verde deschis), P4 (verde mediu) și respectiv P5 (verde închis). Valorile p au fost obținute printr-un test Kolmogorov-Smirnov bilateral. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare.
Prin urmare, am investigat în continuare corelația dintre semnalizarea GA și activitatea diviziunii celulare prin identificarea pereților celulari nou formați în timpul testului (Fig. 5e). Această abordare ne-a permis să măsurăm frecvența și direcția diviziunii celulare. În mod surprinzător, am constatat că frecvența diviziunilor celulare în IPR și restul SAM (non-IPR, Fig. 5f) a fost similară, indicând faptul că diferențele de semnalizare GA între celulele IPR și non-IPR nu afectează semnificativ diviziunea celulară. Acest lucru, precum și corelația pozitivă dintre semnalizarea GA și anizotropia creșterii, ne-au determinat să luăm în considerare dacă activitatea de semnalizare GA ar putea influența orientarea planului de diviziune celulară. Am măsurat orientarea noului perete celular ca un unghi ascuțit față de axa radială care leagă centrul meristemului de centrul noului perete celular (Fig. 5e-i) și am observat o tendință clară a celulelor de a se diviza la unghiuri apropiate de 90° față de axa radială, cu cele mai mari frecvențe observate la 70–80° (23,28%) și 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), corespunzând diviziunilor celulare în direcția circumferențială/transversă (Fig. 5h). Pentru a examina contribuția semnalizării GA la acest comportament de diviziune celulară, am analizat separat parametrii diviziunii celulare în IPR și non-IPR (Fig. 5i). Am observat că distribuția unghiului de diviziune în celulele IPR a diferit de cea din celulele non-IPR sau din celulele din întregul SAM, celulele IPR prezentând o proporție mai mare de diviziuni celulare laterale/circulare, adică 70–80° și 80–90° (33,86% și respectiv 30,71%, proporții corespunzătoare) (Fig. 5i). Astfel, observațiile noastre au relevat o asociere între semnalizarea GA ridicată și o orientare a planului de diviziune celulară apropiată de direcția circumferențială, similară cu corelația dintre activitatea de semnalizare GA și anizotropia de creștere (Fig. 5c, d). Pentru a stabili în continuare conservarea spațială a acestei asocieri, am măsurat orientarea planului de diviziune în celulele IPR care înconjoară primordiul începând de la P3, deoarece cea mai mare activitate de semnalizare GA a fost detectată în această regiune începând de la P4 (Fig. 4). Unghiurile de diviziune ale IPR în jurul P3 și P4 nu au arătat diferențe semnificative statistic, deși s-a observat o frecvență crescută a diviziunilor celulare laterale în IPR în jurul P4 (Fig. 5j). Cu toate acestea, în celulele IPR din jurul punctului P5, diferența de orientare a planului de diviziune celulară a devenit semnificativă statistic, cu o creștere bruscă a frecvenței diviziunilor celulare transversale (Fig. 5j). Împreună, aceste rezultate sugerează că semnalizarea GA poate controla orientarea diviziunilor celulare în SAM, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare40,41 conform cărora o semnalizare GA ridicată poate induce orientarea laterală a diviziunilor celulare în IPR.
Se preconizează că celulele din IPR nu vor fi încorporate în primordii, ci mai degrabă în internoduri2,42,43. Orientarea transversală a diviziunilor celulare în IPR poate duce la organizarea tipică a unor rânduri longitudinale paralele de celule epidermice în internoduri. Observațiile noastre descrise mai sus sugerează că semnalizarea GA joacă probabil un rol în acest proces prin reglarea direcției diviziunii celulare.
Pierderea funcției mai multor gene DELLA are ca rezultat un răspuns GA constitutiv, iar mutanții della pot fi utilizați pentru a testa această ipoteză44. Am analizat mai întâi modelele de expresie a cinci gene DELLA în SAM. Fuziunea transcripțională a liniei GUS45 a relevat că GAI, RGA, RGL1 și RGL2 (într-o măsură mult mai mică) au fost exprimate în SAM (Fig. suplimentară 11a-d). Hibridizarea in situ a demonstrat în continuare că ARNm-ul GAI se acumulează specific în primordii și flori în curs de dezvoltare (Fig. suplimentară 11e). ARNm-ul RGL1 și RGL3 a fost detectat în tot coronamentul SAM și în florile mai vechi, în timp ce ARNm-ul RGL2 a fost mai abundent în regiunea de frontieră (Fig. suplimentară 11f-h). Imagistica confocală a SAM pRGL3::RGL3-GFP a confirmat expresia observată prin hibridizare in situ și a arătat că proteina RGL3 se acumulează în partea centrală a SAM (Fig. suplimentară 11i). Folosind linia pRGA::GFP-RGA, am constatat, de asemenea, că proteina RGA se acumulează în SAM, dar abundența sa scade la graniță începând de la P4 (Fig. suplimentară 11j). În mod special, modelele de expresie ale RGL3 și RGA sunt în concordanță cu o activitate de semnalizare GA mai mare în IPR, detectată prin qmRGA (Fig. 4). Mai mult, aceste date indică faptul că toate DELLA-urile sunt exprimate în SAM și că expresia lor se întinde colectiv pe întregul SAM.
În continuare, am analizat parametrii diviziunii celulare la SAM de tip sălbatic (Ler, control) și la mutanții gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b). Interesant este că am observat o modificare semnificativă statistic a distribuției frecvențelor unghiurilor de diviziune celulară la SAM mutantul della global în comparație cu tipul sălbatic (Fig. 6c). Această modificare la mutantul della global s-a datorat unei creșteri a frecvenței unghiurilor de 80–90° (34,71% vs. 24,55%) și, într-o măsură mai mică, a unghiurilor de 70–80° (23,78% vs. 20,18%), adică corespunzătoare diviziunilor celulare transversale (Fig. 6c). Frecvența diviziunilor non-transversale (0–60°) a fost, de asemenea, mai mică la mutantul della global (Fig. 6c). Frecvența diviziunilor celulare transversale a fost semnificativ crescută la SAM-ul mutantului della global (Fig. 6b). Frecvența diviziunilor celulare transversale în IPR a fost, de asemenea, mai mare în mutantul della global comparativ cu tipul sălbatic (Fig. 6d). În afara regiunii IPR, tipul sălbatic a avut o distribuție mai uniformă a unghiurilor de diviziune celulară, în timp ce mutantul della global a preferat diviziunile tangențiale, precum IPR (Fig. 6e). De asemenea, am cuantificat orientarea diviziunilor celulare în SAM al mutanților cvintupli ga2 oxidazei (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 și ga2ox6-2), un fond mutant inactiv GA în care GA se acumulează. În concordanță cu creșterea nivelurilor de GA, SAM-ul inflorescenței mutante cvintuple ga2ox a fost mai mare decât cel al Col-0 (Fig. suplimentară 12a, b), iar comparativ cu Col-0, SAM-ul cvintuple ga2ox a prezentat o distribuție distinct diferită a unghiurilor de diviziune celulară, frecvența unghiului crescând de la 50° la 90°, adică favorizând din nou diviziunile tangențiale (Fig. suplimentară 12a-c). Astfel, arătăm că activarea constitutivă a semnalizării GA și acumularea de GA induc diviziuni celulare laterale în IPR și în restul SAM-ului.
a, b Vizualizare 3D a stratului L1 al SAM colorat cu PI Ler (a) și mutantul della global (b) utilizând microscopia confocală. Noii pereți celulari formați în SAM (dar nu și în primordiu) pe o perioadă de 10 ore sunt arătați și colorați în funcție de valorile unghiului lor. Inserția prezintă SAM la 0 h. Bara de culori este afișată în colțul din dreapta jos. Săgeata din (b) indică un exemplu de fișiere celulare aliniate în mutantul della global. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. ce comparație a distribuției frecvenței orientărilor planului de diviziune celulară în întregul SAM (d), IPR (e) și non-IPR (f) între Ler și della global. Valorile P au fost obținute utilizând un test Kolmogorov-Smirnov bilateral. f, g Vizualizare 3D a imaginilor confocale ale SAM colorat cu PI ale plantelor transgenice Col-0 (i) și pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panourile (a, b) prezintă noi pereți celulari (dar nu primordii) formați în SAM în decurs de 10 ore. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. h–j Comparație a distribuției frecvenței orientărilor planului de diviziune celulară localizate în întregul SAM (h), IPR (i) și non-IPR (j) între plantele Col-0 și pCUC2::gai-1-VENUS. Valorile P au fost obținute folosind un test Kolmogorov-Smirnov bilateral.
În continuare, am testat efectul inhibării semnalizării GA în mod specific în IPR. În acest scop, am utilizat promotorul cotiledon cup 2 (CUC2) pentru a stimula exprimarea unei proteine gai-1 negative dominante fuzionate cu VENUS (în linia pCUC2::gai-1-VENUS). În SAM de tip sălbatic, promotorul CUC2 stimulează exprimarea majorității IPR-urilor în SAM, inclusiv a celulelor de frontieră, de la P4 încolo, iar o expresie specifică similară a fost observată la plantele pCUC2::gai-1-VENUS (vezi mai jos). Distribuția unghiurilor de diviziune celulară pe SAM sau IPR-ul plantelor pCUC2::gai-1-VENUS nu a fost semnificativ diferită de cea a tipului sălbatic, deși, în mod neașteptat, am constatat că celulele fără IPR din aceste plante s-au divizat la o frecvență mai mare de 80-90° (Fig. 6f-j).
S-a sugerat că direcția diviziunii celulare depinde de geometria SAM, în special de tensiunea de tracțiune generată de curbura țesutului46. Prin urmare, ne-am întrebat dacă forma SAM a fost modificată la plantele mutante della global și pCUC2::gai-1-VENUS. Așa cum s-a raportat anterior12, dimensiunea SAM mutantei della global a fost mai mare decât cea a tipului sălbatic (Fig. suplimentară 13a, b, d). Hibridizarea in situ a ARN-ului CLV3 și STM a confirmat expansiunea meristemului la mutanții della și a arătat în continuare expansiunea laterală a nișei celulelor stem (Fig. suplimentară 13e, f, h, i). Cu toate acestea, curbura SAM a fost similară la ambele genotipuri (Fig. suplimentară 13k, m, n, p). Am observat o creștere similară a dimensiunii la mutantul cvadruplu gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fără o modificare a curburii în comparație cu tipul sălbatic (Fig. suplimentară 13c, d, g, j, l, o, p). Frecvența orientării diviziunii celulare a fost, de asemenea, afectată în mutantul cvadruplu della, dar într-o măsură mai mică decât în mutantul monolitic della (Fig. suplimentară 12d-f). Acest efect de dozare, împreună cu lipsa unui efect asupra curburii, sugerează că activitatea reziduală RGL3 în mutantul cvadruplu Della limitează modificările orientării diviziunii celulare cauzate de pierderea activității DELLA și că modificările diviziunilor celulare laterale apar ca răspuns la modificările activității de semnalizare GA, mai degrabă decât la modificările geometriei SAM. Așa cum s-a descris mai sus, promotorul CUC2 determină expresia IPR în SAM începând de la P4 (Fig. suplimentară 14a, b), iar în schimb, pCUC2::gai-1-VENUS SAM a avut o dimensiune redusă, dar o curbură mai mare (Fig. suplimentară 14c-h). Această modificare a morfologiei pCUC2::gai-1-VENUS SAM poate duce la o distribuție diferită a tensiunilor mecanice în comparație cu tipul sălbatic, în care tensiunile circumferențiale mari încep la o distanță mai scurtă de centrul SAM47. Alternativ, modificările morfologiei pCUC2::gai-1-VENUS SAM pot rezulta din modificări ale proprietăților mecanice regionale induse de expresia transgenei48. În ambele cazuri, acest lucru ar putea compensa parțial efectele modificărilor semnalizării GA prin creșterea probabilității ca celulele să se divizeze în orientarea circumferențială/transversă, explicând observațiile noastre.
Luate împreună, datele noastre confirmă faptul că o semnalizare GA mai mare joacă un rol activ în orientarea laterală a planului de diviziune celulară în IPR. De asemenea, acestea arată că curbura meristemului influențează și orientarea planului de diviziune celulară în IPR.
Orientarea transversală a planului de diviziune în IPR, datorită activității ridicate de semnalizare GA, sugerează că GA pre-organizează un fișier celular radial în epidermă în cadrul SAM pentru a defini organizarea celulară ce va fi găsită ulterior în internodul epidermic. Într-adevăr, astfel de fișiere celulare au fost frecvent vizibile în imaginile SAM ale mutanților della globali (Fig. 6b). Astfel, pentru a explora în continuare funcția de dezvoltare a modelului spațial al semnalizării GA în SAM, am utilizat imagistica time-lapse pentru a analiza organizarea spațială a celulelor din IPR la plantele transgenice de tip sălbatic (Ler și Col-0), mutanții della globali și pCUC2::gai-1-VENUS.
Am constatat că qmRGA a arătat că activitatea de semnalizare GA în IPR a crescut de la P1/P2 și a atins vârful la P4, iar acest model a rămas constant în timp (Fig. 4a-f și Fig. suplimentară 8c-f, k). Pentru a analiza organizarea spațială a celulelor în IPR odată cu creșterea semnalului GA, am etichetat celulele Ler IPR deasupra și pe lateralele P4 în funcție de soarta lor de dezvoltare analizată la 34 de ore după prima observare, adică mai mult de două ori plastidian, permițându-ne să urmărim celulele IPR în timpul dezvoltării primordiumului de la P1/P2 la P4. Am folosit trei culori diferite: galben pentru acele celule care au fost integrate în primordium lângă P4, verde pentru cele care se aflau în IPR și violet pentru cele care au participat la ambele procese (Fig. 7a-c). La t0 (0 h), 1-2 straturi de celule IPR erau vizibile în fața P4 (Fig. 7a). Așa cum era de așteptat, atunci când aceste celule s-au divizat, au făcut-o în principal prin planul de diviziune transversală (Fig. 7a-c). Rezultate similare au fost obținute folosind Col-0 SAM (concentrându-se pe P3, a cărui margine se pliază similar cu P4 în Ler), deși în acest genotip, pliul format la marginea florală a ascuns celulele IPR mai rapid (Fig. 7g–i). Astfel, modelul de diviziune al celulelor IPR pre-organizează celulele în rânduri radiale, ca în internoduri. Organizarea rândurilor radiale și localizarea celulelor IPR între organele succesive sugerează că aceste celule sunt progenitoare internodale.
Aici, am dezvoltat un biosenzor de semnalizare GA ratiometrică, qmRGA, care permite cartografierea cantitativă a activității de semnalizare GA rezultată din concentrațiile combinate de GA și receptori GA, minimizând în același timp interferența cu căile de semnalizare endogene, oferind astfel informații despre funcția GA la nivel celular. În acest scop, am construit o proteină DELLA modificată, mRGA, care și-a pierdut capacitatea de a se lega de partenerii de interacțiune DELLA, dar rămâne sensibilă la proteoliza indusă de GA. qmRGA răspunde atât la modificările exogene, cât și la cele endogene ale nivelurilor de GA, iar proprietățile sale dinamice de detectare permit evaluarea modificărilor spatiotemporale ale activității de semnalizare GA în timpul dezvoltării. qmRGA este, de asemenea, un instrument foarte flexibil, deoarece poate fi adaptat la diferite țesuturi prin schimbarea promotorului utilizat pentru exprimarea sa (dacă este necesar) și, având în vedere natura conservată a căii de semnalizare GA și a motivului PFYRE în angiosperme, este probabil să fie transferabil la alte specii22. În concordanță cu aceasta, s-a demonstrat că o mutație echivalentă în proteina SLR1 DELLA de orez (HYY497AAA) suprimă activitatea de represor de creștere a SLR1, reducând în același timp doar ușor degradarea sa mediată de GA, similar cu mRGA23. În special, studii recente efectuate pe Arabidopsis au arătat că o mutație a unui singur aminoacid în domeniul PFYRE (S474L) a modificat activitatea transcripțională a RGA fără a afecta capacitatea sa de a interacționa cu partenerii factorilor de transcripție50. Deși această mutație este foarte apropiată de cele 3 substituții de aminoacizi prezente în mRGA, studiile noastre arată că aceste două mutații modifică caracteristici distincte ale DELLA. Deși majoritatea partenerilor factorilor de transcripție se leagă de domeniile LHR1 și SAW ale DELLA26,51, unii aminoacizi conservați din domeniul PFYRE pot ajuta la stabilizarea acestor interacțiuni.
Dezvoltarea internodului este o trăsătură cheie în arhitectura plantelor și în îmbunătățirea randamentului. qmRGA a relevat o activitate de semnalizare GA mai mare în celulele progenitoare internodale IPR. Prin combinarea imagisticii cantitative și a geneticii, am arătat că modelele de semnalizare GA suprapun planuri de diviziune celulară circulare/transversale în epiderma SAM, modelând organizarea diviziunii celulare necesară pentru dezvoltarea internodului. Mai mulți regulatori ai orientării planului de diviziune celulară au fost identificați în timpul dezvoltării52,53. Lucrarea noastră oferă un exemplu clar al modului în care activitatea de semnalizare GA reglează acest parametru celular. DELLA poate interacționa cu complexele proteice pre-pliere41, astfel încât semnalizarea GA poate regla orientarea planului de diviziune celulară prin influențarea directă a orientării microtubulilor corticali40,41,54,55. Am arătat în mod neașteptat că în SAM, corelația unei activități de semnalizare GA mai mari nu a fost alungirea sau diviziunea celulară, ci doar anizotropia de creștere, ceea ce este în concordanță cu un efect direct al GA asupra direcției diviziunii celulare în IPR. Cu toate acestea, nu putem exclude că acest efect ar putea fi și indirect, de exemplu mediat de înmuierea peretelui celular indusă de GA56. Modificările proprietăților peretelui celular induc stres mecanic57,58, care poate influența, de asemenea, orientarea planului de diviziune celulară prin afectarea orientării microtubulilor corticali39,46,59. Efectele combinate ale stresului mecanic indus de GA și ale reglării directe a orientării microtubulilor de către GA pot fi implicate în generarea unui model specific de orientare a diviziunii celulare în IPR pentru a defini internodurile, fiind necesare studii suplimentare pentru a testa această idee. În mod similar, studiile anterioare au evidențiat importanța proteinelor TCP14 și 15 care interacționează cu DELLA în controlul formării internodurilor60,61, iar acești factori pot media acțiunea GA împreună cu BREVIPEDICELLUS (BP) și PENNYWISE (PNY), care reglează dezvoltarea internodurilor și s-a demonstrat că influențează semnalizarea GA2,62. Având în vedere că DELLA interacționează cu căile de semnalizare ale brasinosteroidelor, etilenei, acidului jasmonic și acidului abscisic (ABA)63,64 și că acești hormoni pot influența orientarea microtubulilor65, efectele GA asupra orientării diviziunii celulare pot fi mediate și de alți hormoni.
Studiile citologice timpurii au arătat că atât regiunile interioare, cât și cele exterioare ale SAM de Arabidopsis sunt necesare pentru dezvoltarea internodiilor2,42. Faptul că GA reglează activ diviziunea celulară în țesuturile interne12 susține o funcție dublă a GA în reglarea dimensiunii meristemului și internodiului în SAM. Modelul de diviziune celulară direcțională este, de asemenea, strict reglementat în țesutul SAM intern, iar această reglare este esențială pentru creșterea tulpinii52. Va fi interesant de examinat dacă GA joacă, de asemenea, un rol în orientarea planului de diviziune celulară în organizarea SAM internă, sincronizând astfel specificarea și dezvoltarea internodiilor în cadrul SAM.
Plantele au fost cultivate in vitro în sol sau în mediu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) suplimentat cu 1% zaharoză și 1% agar (Sigma) în condiții standard (16 ore de lumină, 22 °C), cu excepția experimentelor de creștere a hipocotilului și a rădăcinilor, în care răsadurile au fost cultivate pe plăci verticale sub lumină constantă și 22 °C. Pentru experimentele cu nitrați, plantele au fost cultivate pe mediu MS modificat (bioWORLD plant medium) suplimentat cu o concentrație adecvată de nitrat (0 sau 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1% zaharoză și 1% A-agar (Sigma) în condiții de zi lungă.
ADNc-ul GID1a inserat în pDONR221 a fost recombinat cu pDONR P4-P1R-pUBQ10 și pDONR P2R-P3-mCherry în pB7m34GW pentru a genera pUBQ10::GID1a-mCherry. ADN-ul IDD2 inserat în pDONR221 a fost recombinat în pB7RWG266 pentru a genera p35S:IDD2-RFP. Pentru a genera pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragment de 3,9 kb în amonte de regiunea codificatoare GID1b și un fragment de 4,7 kb conținând ADNc-ul GID1b (1,3 kb) și terminatorul (3,4 kb) au fost mai întâi amplificate folosind primerii din Tabelul suplimentar 3 și apoi inserate în pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) și respectiv pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) și, în final, recombinate cu pDONR221 2xmTQ268 în vectorul țintă pGreen 012567 folosind clonarea Gateway. Pentru a genera pCUC2::LSSmOrange, secvența promotorului CUC2 (3229 pb în amonte de ATG), urmată de secvența codificatoare a mOrange deplasat cu Stokes mare (LSSmOrange)69 cu semnalul de localizare nucleară N7 și terminatorul transcripțional NOS au fost asamblate în vectorul de direcționare a kanamicinei pGreen folosind sistemul de recombinare Gateway cu 3 fragmente (Invitrogen). Vectorul binar al plantei a fost introdus în tulpina GV3101 de Agrobacterium tumefaciens și introdus în frunzele de Nicotiana benthamiana prin metoda de infiltrare a Agrobacterium și, respectiv, în Arabidopsis thaliana Col-0 prin metoda imersiei florale. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry și pCLV3::mCherry-NLS qmRGA au fost izolate din progeniturile F3 și F1 ale încrucișărilor respective.
Hibridizarea ARN in situ a fost efectuată pe vârfuri de lăstari de aproximativ 1 cm lungime72, care au fost colectate și fixate imediat în soluție FAA (3,7% formaldehidă, 5% acid acetic, 50% etanol) pre-răcită la 4 °C. După 2 tratamente în vid timp de 15 minute, fixativul a fost schimbat și probele au fost incubate peste noapte. ADNc-urile GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 și RGL3 și sondele antisens la 3′-UTR-urile lor au fost sintetizate folosind primerii prezentați în Tabelul suplimentar 3, așa cum este descris de Rosier și colab.73. Sondele marcate cu digoxigenină au fost imunodetectate folosind anticorpi anti-digoxigenină (diluție de 3000 de ori; Roche, număr de catalog: 11 093 274 910), iar secțiunile au fost colorate cu soluție de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat (BCIP, diluție de 250 de ori)/nitroblue tetrazoliu (NBT, diluție de 200 de ori).
Data publicării: 10 februarie 2025