Creșterea meristemului apical (SAM) este esențială pentru arhitectura tulpinii. Hormoni vegetaligibereline(GA) joacă roluri cheie în coordonarea creșterii plantelor, dar rolul lor în SAM rămâne prost înțeles. Aici, am dezvoltat un biosenzor ratiometric de semnalizare GA prin proiectarea proteinei DELLA pentru a suprima funcția sa de reglare esențială în răspunsul transcripțional GA, păstrând în același timp degradarea acesteia la recunoașterea GA. Demonstrăm că acest biosenzor bazat pe degradare înregistrează cu exactitate modificările nivelurilor de GA și detectarea celulară în timpul dezvoltării. Am folosit acest biosenzor pentru a mapa activitatea de semnalizare GA în SAM. Arătăm că semnalele GA ridicate sunt prezente predominant în celulele situate între primordiile de organe, care sunt precursori ai celulelor internodului. Folosind abordări de câștig și pierdere de funcție, demonstrăm în continuare că GA reglează orientarea planului de diviziune celulară, stabilind organizarea celulară canonică a internodurilor, promovând astfel specificația internodurilor în SAM.
Meristemul apical al lăstarilor (SAM), situat la vârful lăstarilor, conține o nișă de celule stem a căror activitate generează organe laterale și noduri stem într-o manieră modulară și iterativă pe toată durata vieții plantei. Fiecare dintre aceste unități repetate, sau noduri de plante, include internoduri și organe laterale la noduri și meristeme axilare în axilele frunzelor1. Creșterea și organizarea nodurilor plantelor se modifică în timpul dezvoltării. La Arabidopsis, creșterea internodală este suprimată în timpul etapei vegetative, iar meristemele axilare rămân latente la axilele frunzelor rozetei. În timpul trecerii la faza florală, SAM devine meristemul inflorescenței, generând internoduri alungite și muguri axilari, ramuri la axilele frunzelor cauline, iar mai târziu, flori fără frunze2. Deși am făcut progrese semnificative în înțelegerea mecanismelor care controlează inițierea frunzelor, florilor și ramurilor, se știe relativ puține despre cum apar internoduri.
Înțelegerea distribuției spațio-temporale a GA va ajuta la înțelegerea mai bună a funcțiilor acestor hormoni în diferite țesuturi și în diferite stadii de dezvoltare. Vizualizarea degradării fuziunii RGA-GFP exprimată sub acțiunea propriului promotor oferă informații importante despre reglarea nivelurilor totale de GA în rădăcini15,16. Cu toate acestea, expresia RGA variază între țesuturi17 și este reglementată de GA18. Astfel, expresia diferențială a promotorului RGA poate duce la modelul de fluorescență observat cu RGA-GFP și, prin urmare, această metodă nu este cantitativă. Mai recent, GA19,20 marcat cu fluoresceină bioactivă (Fl) a relevat acumularea de GA în endocortexul rădăcinii și reglarea nivelurilor sale celulare prin transportul GA. Recent, senzorul GA FRET nlsGPS1 a arătat că nivelurile de GA se corelează cu alungirea celulelor în rădăcini, filamente și hipocotille crescute la culoare21. Cu toate acestea, după cum am văzut, concentrația GA nu este singurul parametru care controlează activitatea de semnalizare GA, deoarece depinde de procesele complexe de detectare. Aici, pe baza înțelegerii noastre a căilor de semnalizare DELLA și GA, raportăm dezvoltarea și caracterizarea unui biosenzor ratiometric bazat pe degradare pentru semnalizarea GA. Pentru a dezvolta acest biosenzor cantitativ, am folosit un RGA mutant sensibil la GA, care a fost fuzionat cu o proteină fluorescentă și exprimat omniprezent în țesuturi, precum și o proteină fluorescentă insensibilă la GA. Arătăm că fuziunile proteinei RGA mutante nu interferează cu semnalizarea GA endogenă atunci când sunt exprimate omniprezent și că acest biosenzor poate cuantifica activitatea de semnalizare rezultată atât din intrarea GA, cât și din procesarea semnalului GA de către aparatul de detectare cu rezoluție spațio-temporală mare. Am folosit acest biosenzor pentru a mapa distribuția spațio-temporală a activității de semnalizare GA și pentru a cuantifica modul în care GA reglează comportamentul celular în epiderma SAM. Demonstrăm că GA reglează orientarea planului de diviziune al celulelor SAM situate între primordiile de organ, definind astfel organizarea celulară canonică a internodului.
În cele din urmă, am întrebat dacă qmRGA ar putea raporta modificări ale nivelurilor endogene de GA folosind hipocotili în creștere. Am arătat anterior că nitratul stimulează creșterea prin creșterea sintezei GA și, la rândul său, degradarea DELLA34. În consecință, am observat că lungimea hipocotilului în răsadurile pUBQ10::qmRGA cultivate sub aprovizionare abundentă de nitrați (10 mM NO3-) a fost semnificativ mai mare decât cea a răsadurilor cultivate în condiții de deficit de nitrați (Figura suplimentară 6a). În concordanță cu răspunsul de creștere, semnalele GA au fost mai mari la hipocotilii răsadurilor cultivate în condiții de 10 mM NO3- decât la răsadurile cultivate în absența nitratului (Figura suplimentară 6b, c). Astfel, qmRGA permite, de asemenea, monitorizarea modificărilor semnalizării GA induse de modificările endogene ale concentrației de GA.
Pentru a înțelege dacă activitatea de semnalizare GA detectată de qmRGA depinde de concentrația GA și percepția GA, așa cum era de așteptat pe baza designului senzorului, am analizat expresia celor trei receptori GID1 în țesuturile vegetative și reproductive. La răsaduri, linia reporter GID1-GUS a arătat că GID1a și c au fost foarte exprimate în cotiledoane (Fig. 3a-c). În plus, toți cei trei receptori au fost exprimați în frunze, primordii laterale ale rădăcinii, vârfuri rădăcinilor (cu excepția capacului rădăcinii GID1b) și în sistemul vascular (Fig. 3a-c). În inflorescența SAM, am detectat semnale GUS numai pentru GID1b și 1c (Fig. 7a-c suplimentare). Hibridizarea in situ a confirmat aceste modele de expresie și a demonstrat în continuare că GID1c a fost exprimat uniform la niveluri scăzute în SAM, în timp ce GID1b a arătat o expresie mai mare la periferia SAM (Figura suplimentară 7d-l). Fuziunea translațională pGID1b::2xmTQ2-GID1b a dezvăluit, de asemenea, o gamă gradată de expresie GID1b, de la expresie scăzută sau inexistentă în centrul SAM până la expresie ridicată la granițele organelor (Fig. 7m suplimentară). Astfel, receptorii GID1 nu sunt distribuiți uniform în și în interiorul țesuturilor. În experimentele ulterioare, am observat, de asemenea, că supraexprimarea GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) a crescut sensibilitatea qmRGA în hipocotili la aplicarea externă a GA (Fig. 3d, e). În schimb, fluorescența măsurată prin qd17mRGA în hipocotil a fost insensibilă la tratamentul cu GA3 (Fig. 3f, g). Pentru ambele teste, răsadurile au fost tratate cu concentrații mari de GA (100 μM GA3) pentru a evalua comportamentul rapid al senzorului, unde capacitatea de a se lega de receptorul GID1 a fost îmbunătățită sau pierdută. Împreună, aceste rezultate confirmă faptul că biosenzorul qmRGA servește o funcție combinată ca senzor GA și GA și sugerează că expresia diferențială a receptorului GID1 poate modula semnificativ emisivitatea senzorului.
Până în prezent, distribuția semnalelor GA în SAM rămâne neclară. Prin urmare, am folosit plante care exprimă qmRGA și reporterul de celule stem pCLV3::mCherry-NLS35 pentru a calcula hărți cantitative de înaltă rezoluție ale activității de semnalizare GA, concentrându-ne pe stratul L1 (epidermă; Fig. 4a, b, vezi Metode și metode suplimentare), deoarece L1 joacă un rol cheie în controlul creșterii SAM3. Aici, expresia pCLV3::mCherry-NLS a oferit un punct de referință geometric fix pentru analiza distribuției spațio-temporale a activității de semnalizare GA37. Deși GA este considerată esențială pentru dezvoltarea organelor laterale4, am observat că semnalele GA au fost scăzute în primordiul floral (P) începând din stadiul P3 (Fig. 4a, b), în timp ce primordiile tinere P1 și P2 au avut o activitate moderată similară cu cea din regiunea centrală (Fig. 4a, b). O activitate de semnalizare GA mai mare a fost detectată la granițele primordiului organului, începând de la P1 / P2 (pe părțile laterale ale graniței) și ajungând la P4, precum și în toate celulele regiunii periferice situate între primordii (Fig. 4a, b și Fig. 8a, b suplimentară). Această activitate de semnalizare GA mai mare a fost observată nu numai în epidermă, ci și în straturile L2 și L3 superioare (Fig. 8b suplimentară). Modelul semnalelor GA detectate în SAM folosind qmRGA a rămas, de asemenea, neschimbat de-a lungul timpului (Fig. 8c–f, k suplimentară). Deși constructul qd17mRGA a fost regulat în mod sistematic în SAM al plantelor T3 din cinci linii independente pe care le-am caracterizat în detaliu, am putut analiza modelele de fluorescență obținute cu constructul pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Figura suplimentară 8g–j, l). În această linie de control, au fost detectate doar modificări minore ale raportului de fluorescență în SAM, dar în centrul SAM am observat o scădere clară și neașteptată a VENUS asociată cu TagBFP. Acest lucru confirmă faptul că modelul de semnalizare observat de qmRGA reflectă degradarea dependentă de GA a mRGA-VENUS, dar demonstrează, de asemenea, că qmRGA poate supraestima activitatea de semnalizare GA în centrul meristemului. În rezumat, rezultatele noastre dezvăluie un model de semnalizare GA care reflectă în primul rând distribuția primordiilor. Această distribuție a regiunii inter-primordiale (IPR) se datorează stabilirii treptate a activității de semnalizare GA ridicată între primordiul în curs de dezvoltare și regiunea centrală, în timp ce, în același timp, activitatea de semnalizare GA în primordiu scade (Fig. 4c, d).
Distribuția receptorilor GID1b și GID1c (vezi mai sus) sugerează că expresia diferențială a receptorilor GA ajută la modelarea modelului activității de semnalizare GA în SAM. Ne-am întrebat dacă acumularea diferențială de GA ar putea fi implicată. Pentru a investiga această posibilitate, am folosit senzorul nlsGPS1 GA FRET21. Frecvența de activare crescută a fost detectată în SAM al nlsGPS1 tratat cu 10 μM GA4 + 7 timp de 100 de minute (Fig. 9a–e suplimentară), indicând faptul că nlsGPS1 răspunde la modificările concentrației de GA în SAM, așa cum face și în rădăcini21. Distribuția spațială a frecvenței de activare a nlsGPS1 a dezvăluit niveluri de GA relativ scăzute în straturile exterioare ale SAM, dar a arătat că acestea au fost ridicate în centrul și la granițele SAM (Fig. 4e și Fig. 9a, c). Acest lucru sugerează că GA este, de asemenea, distribuit în SAM cu un model spațial comparabil cu cel revelat de qmRGA. Ca o abordare complementară, am tratat, de asemenea, SAM cu GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) sau Fl singur ca control negativ. Semnalul Fl a fost distribuit în întreaga SAM, inclusiv în regiunea centrală și primordiu, deși la o intensitate mai mică (Fig. 4j și Fig. 10d suplimentară). În schimb, toate cele trei GA-Fl s-au acumulat în mod specific în granițele primordiului și în grade diferite în restul IPR, GA7-Fl acumulându-se în cel mai mare domeniu din IPR (Fig. 4k și Fig. 10a, b suplimentară). Cuantificarea intensității fluorescenței a arătat că raportul intensității IPR față de non-IPR a fost mai mare în SAM tratat cu GA-Fl comparativ cu SAM tratat cu Fl (Fig. 4l și Fig. 10c suplimentară). Împreună, aceste rezultate sugerează că GA este prezent la concentrații mai mari în celulele IPR care sunt situate cel mai aproape de granița organului. Acest lucru sugerează că modelul activității de semnalizare a SAM GA rezultă atât din expresia diferențială a receptorilor GA, cât și din acumularea diferențială de GA în celulele IPR din apropierea granițelor organelor. Astfel, analiza noastră a relevat un model spațiotemporal neașteptat de semnalizare GA, cu activitate mai scăzută în centrul și primordiul SAM și activitate mai mare în IPR în regiunea periferică.
Pentru a înțelege rolul activității diferențiale de semnalizare GA în SAM, am analizat corelația dintre activitatea de semnalizare GA, expansiunea celulară și diviziunea celulară folosind imagini în timp real ale SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Având în vedere rolul GA în reglarea creșterii, era de așteptat o corelație pozitivă cu parametrii de expansiune celulară. Prin urmare, am comparat mai întâi hărțile activității de semnalizare GA cu hărți ale ratei de creștere a suprafeței celulare (ca proxy pentru puterea expansiunii celulare pentru o anumită celulă și pentru celulele fiice la diviziune) și cu hărțile anizotropiei de creștere, care măsoară direcționalitatea expansiunii celulare (utilizată și aici pentru o anumită celulă și pentru celulele fiice la diviziune; Fig. 5a, b, vezi Metode). Hărțile noastre ale ratei de creștere a suprafeței celulelor SAM sunt în concordanță cu observațiile anterioare38,39, cu rate minime de creștere la graniță și rate maxime de creștere în florile în curs de dezvoltare (Fig. 5a). Analiza componentelor principale (PCA) a arătat că activitatea de semnalizare GA a fost corelată negativ cu intensitatea creșterii suprafeței celulare (Figura 5c). De asemenea, am arătat că principalele axe de variație, inclusiv intrarea de semnalizare GA și intensitatea creșterii, au fost ortogonale cu direcția determinată de expresia CLV3 ridicată, confirmând excluderea celulelor din centrul SAM în analizele rămase. Analiza de corelație Spearman a confirmat rezultatele PCA (Figura 5d), indicând că semnalele GA mai mari în IPR nu au dus la o expansiune mai mare a celulelor. Cu toate acestea, analiza corelației a relevat o ușoară corelație pozitivă între activitatea de semnalizare GA și anizotropia de creștere (Figura 5c, d), sugerând că semnalizarea GA mai mare în IPR influențează direcția de creștere a celulei și, eventual, poziția planului de diviziune celulară.
a, b Hărțile termice ale creșterii medii de suprafață (a) și ale anizotropiei de creștere (b) în SAM au avut o medie pe șapte plante independente (utilizate ca indicatori pentru puterea și, respectiv, direcția expansiunii celulare). c Analiza PCA a inclus următoarele variabile: semnal GA, intensitatea creșterii la suprafață, anizotropia creșterii la suprafață și expresia CLV3. Componenta 1 PCA a fost în principal corelată negativ cu intensitatea creșterii suprafeței și corelată pozitiv cu semnalul GA. Componenta 2 PCA a fost în principal corelată pozitiv cu anizotropia de creștere a suprafeței și corelată negativ cu expresia CLV3. Procentele reprezintă variația explicată de fiecare componentă. d Analiza corelației Spearman între semnalul GA, intensitatea creșterii la suprafață și anizotropia creșterii la suprafață la scara țesuturilor, excluzând CZ. Numărul din dreapta este valoarea Spearman rho între două variabile. Asteriscurile indică cazurile în care corelația/corelația negativă este foarte semnificativă. e Vizualizarea 3D a celulelor Col-0 SAM L1 prin microscopie confocală. Pereții celulari noi formați în SAM (dar nu primordiul) la 10 h sunt colorați în funcție de valorile unghiului lor. Bara de culori este afișată în colțul din dreapta jos. Insertul arată imaginea 3D corespunzătoare la 0 h. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. f Box-ploturile afișează ratele de diviziune celulară în IPR și non-IPR Col-0 SAM (n = 10 plante independente). Linia centrală arată mediana, iar limitele casetei indică percentilele 25 și 75. Mustații indică valorile minime și maxime determinate cu software-ul R. Valorile P au fost obținute cu testul t cu două cozi al lui Welch. g, h Diagrama schematică care arată (g) cum se măsoară unghiul noului perete celular (magenta) în raport cu direcția radială din centrul SAM (linia punctată albă) (se iau în considerare numai valorile unghiului acut, adică 0–90°) și (h) direcțiile circumferențiale/laterale și radiale din meristem. i Histograme de frecvență ale orientării planului de diviziune celulară în SAM (albastru închis), IPR (albastru mediu) și, respectiv, non-IPR (albastru deschis). Valorile P au fost obținute printr-un test Kolmogorov-Smirnov cu două cozi. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. j Histograme de frecvență ale orientării planului de diviziune celulară a IPR în jurul P3 (verde deschis), P4 (verde mediu) și, respectiv, P5 (verde închis). Valorile P au fost obținute printr-un test Kolmogorov-Smirnov cu două cozi. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare.
Prin urmare, am investigat apoi corelația dintre semnalizarea GA și activitatea diviziunii celulare prin identificarea pereților celulari nou formați în timpul testului (Fig. 5e). Această abordare ne-a permis să măsurăm frecvența și direcția diviziunii celulare. În mod surprinzător, am descoperit că frecvența diviziunilor celulare în IPR și restul SAM (non-IPR, Fig. 5f) a fost similară, ceea ce indică faptul că diferențele de semnalizare GA între celulele IPR și non-IPR nu afectează semnificativ diviziunea celulară. Acest lucru și corelația pozitivă dintre semnalizarea GA și anizotropia de creștere ne-au determinat să luăm în considerare dacă activitatea de semnalizare GA ar putea influența orientarea planului de diviziune celulară. Am măsurat orientarea noului perete celular ca un unghi ascuțit în raport cu axa radială care leagă centrul meristemului și centrul noului perete celular (Fig. 5e-i) și am observat o tendință clară a celulelor de a se împărți la unghiuri apropiate de 90 ° față de axa radială, cu frecvențele cele mai înalte observate la 70–80–28% (28,28%) (28,28,2%) (28,28,2%) (Fig. 5e, i), corespunzătoare diviziunilor celulare în direcția circumferențială/transversală (Fig. 5h). Pentru a examina contribuția semnalizării GA la acest comportament de diviziune celulară, am analizat separat parametrii diviziunii celulare în IPR și non-IPR (Fig. 5i). Am observat că distribuția unghiului de diviziune în celulele IPR a fost diferită de cea în celulele non-IPR sau în celulele din întregul SAM, celulele IPR prezentând o proporție mai mare de diviziuni celulare laterale/circulare, adică 70–80° și 80–90° (33,86% și, respectiv, 30,71%, proporții corespunzătoare) (Fig. 5i). Astfel, observațiile noastre au relevat o asociere între semnalizarea GA ridicată și o orientare a planului de diviziune celulară aproape de direcția circumferențială, similară cu corelația dintre activitatea de semnalizare GA și anizotropia de creștere (Fig. 5c, d). Pentru a stabili în continuare conservarea spațială a acestei asocieri, am măsurat orientarea planului de diviziune în celulele IPR din jurul primordiului începând de la P3, deoarece cea mai mare activitate de semnalizare GA a fost detectată în această regiune începând de la P4 (Fig. 4). Unghiurile de diviziune ale IPR în jurul P3 și P4 nu au arătat diferențe semnificative statistic, deși a fost observată o frecvență crescută a diviziunilor celulare laterale în IPR în jurul P4 (Fig. 5j). Cu toate acestea, în celulele IPR din jurul P5, diferența de orientare a planului de diviziune celulară a devenit semnificativă statistic, cu o creștere bruscă a frecvenței diviziunilor celulare transversale (Fig. 5j). Împreună, aceste rezultate sugerează că semnalizarea GA poate controla orientarea diviziunilor celulare în SAM, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare40,41 că semnalizarea GA ridicată poate induce orientarea laterală a diviziunilor celulare în IPR.
Se prevede că celulele din IPR nu vor fi încorporate în primordii, ci mai degrabă în internoduri2,42,43. Orientarea transversală a diviziunilor celulare în IPR poate duce la organizarea tipică a rândurilor longitudinale paralele de celule epidermice în internoduri. Observațiile noastre descrise mai sus sugerează că semnalizarea GA joacă probabil un rol în acest proces prin reglarea direcției diviziunii celulare.
Pierderea funcției mai multor gene DELLA are ca rezultat un răspuns constitutiv GA, iar mutanții della pot fi utilizați pentru a testa această ipoteză44. Am analizat mai întâi modelele de expresie a cinci gene DELLA în SAM. Fuziunea transcripțională a liniei GUS45 a dezvăluit că GAI, RGA, RGL1 și RGL2 (într-o măsură mult mai mică) au fost exprimate în SAM (Figura suplimentară 11a-d). Hibridizarea in situ a demonstrat în continuare că ARNm GAI se acumulează în mod specific în primordii și flori în curs de dezvoltare (Fig. 11e suplimentară). ARNm RGL1 și RGL3 au fost detectați în întregul baldachin SAM și în florile mai vechi, în timp ce ARNm RGL2 a fost mai abundent în regiunea de graniță (Fig. 11f-h suplimentară). Imagistica confocală a pRGL3::RGL3-GFP SAM a confirmat expresia observată prin hibridizarea in situ și a arătat că proteina RGL3 se acumulează în partea centrală a SAM (Fig. 11i suplimentară). Folosind linia pRGA::GFP-RGA, am constatat, de asemenea, că proteina RGA se acumulează în SAM, dar abundența sa scade la graniță începând de la P4 (Figura suplimentară 11j). În special, modelele de expresie ale RGL3 și RGA sunt în concordanță cu o activitate de semnalizare GA mai mare în IPR, așa cum este detectată de qmRGA (Fig. 4). Mai mult, aceste date indică faptul că toate DELLA sunt exprimate în SAM și că expresia lor se întinde colectiv pe întregul SAM.
Apoi am analizat parametrii diviziunii celulare în SAM de tip sălbatic (Ler, control) și gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 de la cvintuplii (globali) mutanți (Fig. 6a, b). Interesant, am observat o schimbare semnificativă statistic în distribuția frecvențelor unghiului de diviziune celulară în SAM mutant global della, în comparație cu tipul sălbatic (Fig. 6c). Această modificare a mutantului global s-a datorat unei creșteri a frecvenței unghiurilor de 80–90° (34,71% față de 24,55%) și, într-o măsură mai mică, unghiurilor de 70–80 ° (23,78% față de 20,18%), adică corespunzătoare diviziunilor celulare transversale (Fig. 6c). Frecvența diviziunilor netransversale (0–60 °) a fost, de asemenea, mai mică la mutantul global della (Fig. 6c). Frecvența diviziunilor celulare transversale a fost crescută semnificativ în SAM al mutantului global della (Fig. 6b). Frecvența diviziunilor celulare transversale în IPR a fost, de asemenea, mai mare la mutantul global, comparativ cu tipul sălbatic (Fig. 6d). În afara regiunii IPR, tipul sălbatic a avut o distribuție mai uniformă a unghiurilor de diviziune celulară, în timp ce mutantul global della a preferat diviziunile tangențiale precum IPR (Fig. 6e). De asemenea, am cuantificat orientarea diviziunilor celulare în SAM al mutanților cvintupli de ga2 oxidază (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 și ga2ox6-2), un fundal mutant inactiv GA în care se acumulează GA. În concordanță cu creșterea nivelurilor de GA, SAM al inflorescenței mutante ga2ox cvintupla a fost mai mare decât cea a Col-0 (Figura suplimentară 12a, b), iar în comparație cu Col-0, SAM cvintuplu ga2ox a arătat o distribuție distinctă a unghiurilor de diviziune celulară, frecvența unghiului crescând de la 50°, diviziunea tangenţială din nou favorabilă Fig. 12a–c). Astfel, arătăm că activarea constitutivă a semnalizării GA și acumularea GA induc diviziuni celulare laterale în IPR și restul SAM.
a, b Vizualizarea 3D a stratului L1 de Ler colorat cu PI (a) și SAM global della mutant (b) folosind microscopia confocală. Pereții celulari noi formați în SAM (dar nu în primordiu) pe o perioadă de 10 ore sunt afișați și colorați în funcție de valorile unghiului lor. Insertul arată SAM la 0 h. Bara de culori este afișată în colțul din dreapta jos. Săgeata din (b) indică un exemplu de fișiere de celule aliniate din mutantul global. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. ce comparație a distribuției de frecvență a orientărilor planului de diviziune celulară în întregul SAM (d), IPR (e) și non-IPR (f) între Ler și global della. Valorile P au fost obținute folosind un test Kolmogorov-Smirnov cu două cozi. f, g Vizualizarea 3D a imaginilor confocale ale SAM colorate cu PI ale plantelor transgenice Col-0 (i) și pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panourile (a, b) arată noi pereți celulari (dar nu primordii) formați în SAM în decurs de 10 ore. Experimentul a fost repetat de două ori cu rezultate similare. h–j Comparație a distribuției de frecvență a orientărilor planului de diviziune celulară situate în întregul SAM (h), IPR (i) și non-IPR (j) între plantele Col-0 și pCUC2::gai-1-VENUS. Valorile P au fost obținute folosind un test Kolmogorov-Smirnov cu două cozi.
Apoi am testat efectul inhibării semnalizării GA în mod specific în IPR. În acest scop, am folosit promotorul cupă cotiledon 2 (CUC2) pentru a determina expresia unei proteine gai-1 negative dominante fuzionate cu VENUS (în linia pCUC2::gai-1-VENUS). În SAM de tip sălbatic, promotorul CUC2 conduce expresia majorității IPR-urilor în SAM, inclusiv celulele de graniță, de la P4 încolo, și o expresie specifică similară a fost observată în plantele pCUC2::gai-1-VENUS (vezi mai jos). Distribuția unghiurilor de diviziune celulară în SAM sau IPR plantelor pCUC2::gai-1-VENUS nu a fost semnificativ diferită de cea a tipului sălbatic, deși în mod neașteptat am constatat că celulele fără IPR din aceste plante s-au împărțit la o frecvență mai mare de 80-90 ° (Fig. 6f-j).
S-a sugerat că direcția diviziunii celulare depinde de geometria SAM, în special de efortul de tracțiune generat de curbura țesutului46. Prin urmare, am întrebat dacă forma SAM a fost modificată în plantele mutante globale și pCUC2::gai-1-VENUS. După cum sa raportat anterior12, dimensiunea mutantului global SAM a fost mai mare decât cea a tipului sălbatic (Fig. 13a, b, d suplimentare). Hibridizarea in situ a ARN-ului CLV3 și STM a confirmat expansiunea meristemului la mutanți și a arătat în continuare expansiunea laterală a nișei de celule stem (Figura suplimentară 13e, f, h, i). Cu toate acestea, curbura SAM a fost similară în ambele genotipuri (Figura suplimentară 13k, m, n, p). Am observat o creștere similară a dimensiunii gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della cvadruplu mutant fără o modificare a curburii în comparație cu tipul sălbatic (Figura suplimentară 13c, d, g, j, l, o, p). Frecvența orientării diviziunii celulare a fost, de asemenea, afectată la mutantul cvadruplu della, dar într-o măsură mai mică decât la mutantul monolitic della (fig. 12d-f suplimentară). Acest efect de dozare, împreună cu lipsa unui efect asupra curburii, sugerează că activitatea RGL3 reziduală în mutantul cvadruplu Della limitează modificările orientării diviziunii celulare cauzate de pierderea activității DELLA și că modificările diviziunilor celulare laterale apar ca răspuns la modificările activității de semnalizare GA, mai degrabă decât modificările geometriei SAM. După cum s-a descris mai sus, promotorul CUC2 conduce expresia IPR în SAM începând de la P4 (Fig. 14a, b suplimentară) și, în contrast, pCUC2::gai-1-VENUS SAM a avut o dimensiune redusă, dar o curbură mai mare (Fig. 14c-h suplimentară). Această modificare a morfologiei pCUC2::gai-1-VENUS SAM poate duce la o distribuție diferită a tensiunilor mecanice în comparație cu tipul sălbatic, în care solicitările circumferențiale mari încep la o distanță mai mică de centrul SAM47. Alternativ, modificările morfologiei pCUC2::gai-1-VENUS SAM pot rezulta din modificări ale proprietăților mecanice regionale induse de expresia transgenei48. În ambele cazuri, acest lucru ar putea compensa parțial efectele modificărilor semnalizării GA prin creșterea probabilității ca celulele să se dividă în orientarea circumferențială/transversală, explicând observațiile noastre.
Luate împreună, datele noastre confirmă că semnalizarea GA mai mare joacă un rol activ în orientarea laterală a planului de diviziune celulară în IPR. De asemenea, ei arată că curbura meristemului influențează și orientarea planului de diviziune celulară în IPR.
Orientarea transversală a planului de diviziune în IPR, datorită activității mari de semnalizare GA, sugerează că GA pre-organizează un fișier de celule radiale în epidermă în cadrul SAM pentru a defini organizarea celulară care va fi găsită ulterior în internodul epidermal. Într-adevăr, astfel de fișiere celulare au fost frecvent vizibile în imaginile SAM ale mutanților globali (Fig. 6b). Astfel, pentru a explora în continuare funcția de dezvoltare a modelului spațial al semnalizării GA în SAM, am folosit imagistica time-lapse pentru a analiza organizarea spațială a celulelor din IPR în plantele transgenice de tip sălbatic (Ler și Col-0), della global mutanți și pCUC2::gai-1-VENUS.
Am descoperit că qmRGA a arătat că activitatea de semnalizare GA în IPR a crescut de la P1/P2 și a atins un vârf la P4, iar acest model a rămas constant în timp (Fig. 4a–f și Fig. 8c–f, k). Pentru a analiza organizarea spațială a celulelor în IPR cu creșterea semnalului GA, am etichetat celulele Ler IPR deasupra și pe părțile laterale ale lui P4 în funcție de soarta lor de dezvoltare analizată la 34 de ore după prima observație, adică mai mult de doi timpi plastid, permițându-ne să urmărim celulele IPR în timpul dezvoltării primordiului de la P1/P2 la P4. Am folosit trei culori diferite: galben pentru acele celule care au fost integrate în primordiu lângă P4, verde pentru cele care au fost în IPR și violet pentru cele care au participat la ambele procese (Fig. 7a-c). La t0 (0 h), 1-2 straturi de celule IPR au fost vizibile în fața lui P4 (Fig. 7a). După cum era de așteptat, atunci când aceste celule s-au divizat, au făcut-o în principal prin planul de diviziune transversală (Figurile 7a-c). Rezultate similare au fost obținute utilizând Col-0 SAM (concentrându-se pe P3, a cărui margine se pliază similar cu P4 în Ler), deși în acest genotip pliul format la marginea florală a ascuns celulele IPR mai repede (Fig. 7g–i). Astfel, modelul de diviziune al celulelor IPR pre-organizează celulele în rânduri radiale, ca în internoduri. Organizarea rândurilor radiale și localizarea celulelor IPR între organe succesive sugerează că aceste celule sunt progenitoare internodale.
Aici, am dezvoltat un biosenzor de semnalizare GA ratiometric, qmRGA, care permite cartografierea cantitativă a activității de semnalizare GA rezultată din concentrațiile combinate ale receptorilor GA și GA, minimizând în același timp interferența cu căile endogene de semnalizare, oferind astfel informații despre funcția GA la nivel celular. În acest scop, am construit o proteină DELLA modificată, mRGA, care și-a pierdut capacitatea de a lega partenerii de interacțiune DELLA, dar rămâne sensibilă la proteoliza indusă de GA. qmRGA răspunde atât la modificările exogene, cât și la cele endogene ale nivelurilor GA, iar proprietățile sale dinamice de detectare permit evaluarea modificărilor spațio-temporale ale activității de semnalizare GA în timpul dezvoltării. qmRGA este, de asemenea, un instrument foarte flexibil, deoarece poate fi adaptat la diferite țesuturi prin schimbarea promotorului utilizat pentru exprimarea sa (dacă este necesar) și având în vedere natura conservată a căii de semnalizare GA și motivul PFYRE în angiosperme, este probabil să fie transferabil altor specii22. În concordanță cu aceasta, s-a demonstrat că o mutație echivalentă a proteinei DELLA de orez SLR1 (HYY497AAA) suprimă activitatea represorului de creștere a SLR1, reducând în același timp doar puțin degradarea mediată de GA, similar cu mRGA23. În special, studii recente în Arabidopsis au arătat că o singură mutație a aminoacizilor în domeniul PFYRE (S474L) a modificat activitatea transcripțională a RGA fără a afecta capacitatea sa de a interacționa cu partenerii factorului de transcripție50. Deși această mutație este foarte aproape de substituțiile de 3 aminoacizi prezente în mRGA, studiile noastre arată că aceste două mutații modifică caracteristici distincte ale DELLA. Deși majoritatea partenerilor factorilor de transcripție se leagă de domeniile LHR1 și SAW ale DELLA26,51, unii aminoacizi conservați din domeniul PFYRE pot ajuta la stabilizarea acestor interacțiuni.
Dezvoltarea internodurilor este o trăsătură cheie în arhitectura plantelor și îmbunătățirea randamentului. qmRGA a dezvăluit o activitate de semnalizare GA mai mare în celulele progenitoare internodului IPR. Prin combinarea imaginilor cantitative și a geneticii, am arătat că modelele de semnalizare GA suprapun planuri de diviziune celulară circulară/transversală în epiderma SAM, modelând organizarea diviziunii celulare necesară dezvoltării internodurilor. Mai mulți regulatori ai orientării planului de diviziune celulară au fost identificați în timpul dezvoltării52,53. Munca noastră oferă un exemplu clar al modului în care activitatea de semnalizare GA reglează acest parametru celular. DELLA poate interacționa cu complexele proteice de prepliere41, astfel încât semnalizarea GA poate regla orientarea planului de diviziune celulară influențând direct orientarea microtubulilor corticali40,41,54,55. Am arătat în mod neașteptat că în SAM, corelația activității de semnalizare GA mai mare nu a fost alungirea sau diviziunea celulară, ci doar anizotropia de creștere, care este în concordanță cu un efect direct al GA asupra direcției diviziunii celulare în IPR. Cu toate acestea, nu putem exclude că acest efect ar putea fi și indirect, de exemplu mediat de înmuierea peretelui celular indusă de GA56. Modificările proprietăților peretelui celular induc stres mecanic57,58, care poate influența și orientarea planului de diviziune celulară prin afectarea orientării microtubulilor corticali39,46,59. Efectele combinate ale stresului mecanic indus de GA și reglarea directă a orientării microtubulilor de către GA pot fi implicate în generarea unui model specific de orientare a diviziunii celulare în IPR pentru a defini internoduri și sunt necesare studii suplimentare pentru a testa această idee. În mod similar, studiile anterioare au evidențiat importanța proteinelor care interacționează cu DELLA TCP14 și 15 în controlul formării internodurilor60,61 și acești factori pot media acțiunea GA împreună cu BREVIPEDICELLUS (BP) și PENNYWISE (PNY), care reglează dezvoltarea internodurilor și s-a demonstrat că influențează semnalizarea GA2,62. Având în vedere că DELLA interacționează cu căile de semnalizare brasinosteroid, etilenă, acid iasmonic și acid abscisic (ABA)63,64 și că acești hormoni pot influența orientarea microtubulilor65, efectele GA asupra orientării diviziunii celulare pot fi, de asemenea, mediate de alți hormoni.
Studiile citologice timpurii au arătat că atât regiunile interioare, cât și cele exterioare ale Arabidopsis SAM sunt necesare pentru dezvoltarea internodurilor2,42. Faptul că GA reglează activ diviziunea celulară în țesuturile interioare12 susține o funcție dublă a GA în reglarea mărimii meristemului și internodului în SAM. Modelul diviziunii celulare direcționale este, de asemenea, strâns reglementat în țesutul SAM interior, iar această reglare este esențială pentru creșterea tulpinii52. Va fi interesant de examinat dacă GA joacă, de asemenea, un rol în orientarea planului diviziunii celulare în organizarea interioară SAM, sincronizând astfel specificația și dezvoltarea internodurilor în SAM.
Plantele au fost cultivate in vitro în sol sau 1x mediu Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) suplimentat cu 1% zaharoză și 1% agar (Sigma) în condiții standard (16 ore de lumină, 22 °C), cu excepția experimentelor de creștere cu hipocotil și rădăcină în care răsadurile au fost crescute pe plăci verticale la lumină constantă și 22 °C. Pentru experimentele cu nitrați, plantele au fost crescute pe mediu MS modificat (mediu de plante bioWORLD) suplimentat cu nitrat adecvat (0 sau 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinat, 1% zaharoză și 1% A-agar (Sigma) în condiții de zi lungă.
ADNc GID1a inserat în pDONR221 a fost recombinat cu pDONR P4-P1R-pUBQ10 și pDONR P2R-P3-mCherry în pB7m34GW pentru a genera pUBQ10::GID1a-mCherry. ADN-ul IDD2 inserat în pDONR221 a fost recombinat în pB7RWG266 pentru a genera p35S:IDD2-RFP. Pentru a genera pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragment de 3,9 kb în amonte de regiunea de codificare GID1b și un fragment de 4,7 kb care conține ADNc GID1b (1,3 kb) și terminatorul (3,4 kb) au fost mai întâi amplificați utilizând primerii din tabelul suplimentar P1R (Fish-ul inserat în tabelul P1R, apoi PR4). Scientific) și respectiv pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), și în cele din urmă recombinat cu pDONR221 2xmTQ268 în vectorul țintă pGreen 012567 folosind clonarea Gateway. Pentru a genera pCUC2::LSSmOrange, secvența promotorului CUC2 (3229 bp în amonte de ATG) urmată de secvența de codificare a mOrange mare deplasat Stokes (LSSmOrange)69 cu semnalul de localizare nucleară N7 și terminatorul transcripțional NOS au fost asamblate în vectorul pGreen de țintire a sistemului de recombinare kanamycin3, folosind sistemul de țintire a kanamicinei. (Invitrogen). Vectorul binar al plantei a fost introdus în Agrobacterium tumefaciens tulpina GV3101 și introdus în frunzele de Nicotiana benthamiana prin metoda de infiltrare cu Agrobacterium și, respectiv, în Arabidopsis thaliana Col-0 prin metoda prin scufundare florală. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry și pCLV3::mCherry-NLS qmRGA au fost izolate din descendenții F3 și, respectiv, F1 ai încrucișărilor respective.
Hibridizarea in situ a ARN a fost efectuată pe vârfuri de lăstari lungi de aproximativ 1 cm72, care au fost colectate și fixate imediat în soluție FAA (3,7% formaldehidă, 5% acid acetic, 50% etanol) pre-răcită la 4 °C. După tratamente cu vid de 2 × 15 min, fixativul a fost schimbat și probele au fost incubate peste noapte. ADNc-urile GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 și RGL3 și sondele antisens la 3′-UTR-urile lor au fost sintetizate folosind primerii prezentați în Tabelul suplimentar 3, așa cum este descris de Rosier și colab.73. Sondele marcate cu digoxigenină au fost imunodetectate utilizând anticorpi digoxigenină (diluție de 3000 de ori; Roche, număr de catalog: 11 093 274 910), iar secțiunile au fost colorate cu fosfat de 5-brom-4-clor-3-indolil (BCIP, 250-dilutru, NBIP, 250-dizoliu) diluție de 200 de ori) soluție.
Ora postării: 10-feb-2025