Proteinele DELLA sunt conservateregulatori de creșterecare joacă un rol central în dezvoltarea plantelor ca răspuns la semnale interne și externe. Ca regulatori transcripționali, DELLA se leagă de factorii de transcripție (TF) și de histona H2A prin intermediul domeniilor lor GRAS și sunt recrutați pentru a acționa asupra promotorilor. Studii recente au arătat că stabilitatea DELLA este reglată post-translațional prin două mecanisme: polubiquitinarea indusă de hormonul vegetalgiberelină, ceea ce duce la degradarea lor rapidă și la conjugarea cu un modificator mic de tip ubiquitin (SUMO), care le crește acumularea. Mai mult, activitatea DELLA este reglată dinamic de două mecanisme distincte de glicozilare: O-fucozilarea sporește interacțiunea DELLA-TF, în timp ce modificarea N-acetilglucozaminei legate de O (O-GlcNAc) inhibă interacțiunea DELLA-TF. Cu toate acestea, rolul fosforilării DELLA este neclar, deoarece studiile anterioare au arătat rezultate contradictorii, unele sugerând că fosforilarea promovează sau reprimă degradarea DELLA, iar altele sugerând că fosforilarea nu afectează stabilitatea acestora. Aici, identificăm situsurile de fosforilare în represorul GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificat din Arabidopsis thaliana prin spectrometrie de masă și arătăm că fosforilarea a două peptide RGA în regiunile PolyS și PolyS/T sporește activitatea RGA prin promovarea legării H2A și a asocierii RGA cu promotorii țintă. În mod special, fosforilarea nu a afectat interacțiunile RGA-TF sau stabilitatea RGA. Studiul nostru relevă un mecanism molecular prin care fosforilarea induce activitatea DELLA.
Analiza noastră spectrometrică de masă a relevat că atât Pep1, cât și Pep2 au fost puternic fosforilate în RGA în contextul Ga1 cu deficit de GA. Pe lângă acest studiu, studiile fosfoproteomice au relevat, de asemenea, fosforilarea Pep1 în RGA, deși rolul său nu a fost încă studiat53,54,55. În schimb, fosforilarea Pep2 nu a fost descrisă anterior, deoarece această peptidă a putut fi detectată doar folosind transgena RGAGKG. Deși mutația m1A, care a abolit fosforilarea Pep1, a redus doar ușor activitatea RGA în planta, aceasta a avut un efect aditiv atunci când a fost combinată cu m2A în reducerea activității RGA (Figura suplimentară 6). Este important de menționat că fosforilarea Pep1 a fost semnificativ redusă în mutantul sly1 îmbunătățit cu GA în comparație cu ga1, sugerând că GA promovează defosforilarea RGA, reducându-i activitatea. Mecanismul prin care GA suprimă fosforilarea RGA necesită investigații suplimentare. O posibilitate este ca acest lucru să fie realizat prin reglarea unei protein kinaze neidentificate. Deși studiile au arătat că exprimarea proteinkinazei CK1 EL1 este reglată negativ de GA la orez41, rezultatele noastre indică faptul că mutațiile de ordin superior ale omologului Arabidopsis EL1 (AEL1-4) nu reduc fosforilarea RGA. În acord cu rezultatele noastre, un studiu fosfoproteomic recent care a utilizat linii care supraexprimă Arabidopsis AEL și un mutant triplu ael nu a identificat nicio proteină DELLA ca substraturi ale acestor kinaze56. Când am pregătit manuscrisul, s-a raportat că GSK3, gena care codifică o kinază de tip GSK3/SHAGGY la grâu (Triticum aestivum), poate fosforila DELLA (Rht-B1b)57, deși fosforilarea Rht-B1b de către GSK3 nu a fost confirmată in planta. Reacțiile enzimatice in vitro în prezența GSK3, urmate de analiza prin spectrometrie de masă, au relevat trei situsuri de fosforilare situate între domeniile DELLA și GRAS ale Rht-B1b (Figura suplimentară 3). Substituțiile de serină cu alanină la toate cele trei situsuri de fosforilare au dus la o scădere a activității Rht-B1b în grâul transgenic, în concordanță cu descoperirile noastre conform cărora substituțiile de alanină în Pep2 RGA au scăzut activitatea RGA. Cu toate acestea, testele in vitro de degradare a proteinelor au demonstrat în continuare că fosforilarea poate stabiliza și Rht-B1b57. Acest lucru este în contrast cu rezultatele noastre care arată că substituțiile de alanină în Pep2 RGA nu îi modifică stabilitatea în plante. GSK3 în grâu este un ortolog al proteinei 2 insensibile la brasinosteroide (BIN2) în Arabidopsis 57. BIN2 este un regulator negativ al semnalizării BR, iar BR activează calea sa de semnalizare prin provocarea degradării BIN2 58. Am arătat că tratamentul cu BR nu reduce stabilitatea RGA 59 sau nivelurile de fosforilare în Arabidopsis (Figura suplimentară 2), sugerând că este puțin probabil ca RGA să fie fosforilat de BIN2.
Toate datele cantitative au fost analizate statistic folosind Excel, iar diferențele semnificative au fost determinate folosind testul t Student. Nu s-au utilizat metode statistice pentru a predetermina dimensiunea eșantionului. Nu au fost excluse date din analiză; experimentul nu a fost randomizat; iar cercetătorii au fost conștienți de alocare în timpul experimentului și al evaluării rezultatelor. Dimensiunile eșantioanelor sunt furnizate în legendele figurilor și în fișierele cu date brute.
Data publicării: 15 aprilie 2025