Acest studiu a evaluat letalitatea, subletalitatea și toxicitatea substanțelor comercialecipermetrinăformulări la mormoloci de anuran. În testul acut, au fost testate concentrații de 100–800 μg/L timp de 96 de ore. În testul cronic, au fost testate concentrațiile de cipermetrină naturală (1, 3, 6 și 20 μg/L) pentru mortalitate, urmate de testarea micronucleului și a anomaliilor nucleare ale globulelor roșii timp de 7 zile. LC50 a formulării comerciale de cipermetrină la mormoloci a fost de 273,41 μg L−1. În testul cronic, cea mai mare concentrație (20 μg L−1) a dus la o mortalitate mai mare de 50%, deoarece a ucis jumătate dintre mormolocii testați. Testul micronucleului a arătat rezultate semnificative la 6 și 20 μg L−1 și au fost detectate mai multe anomalii nucleare, indicând faptul că formularea comercială de cipermetrină are potențial genotoxic împotriva P. gracilis. Cipermetrina prezintă un risc ridicat pentru această specie, indicând faptul că poate cauza multiple probleme și poate afecta dinamica acestui ecosistem pe termen scurt și lung. Prin urmare, se poate concluziona că formulările comerciale de cipermetrină au efecte toxice asupra P. gracilis.
Datorită extinderii continue a activităților agricole și aplicării intensive acombaterea dăunătorilorÎn cadrul măsurilor de precauție, animalele acvatice sunt frecvent expuse la pesticide1,2. Poluarea resurselor de apă din apropierea terenurilor agricole poate afecta dezvoltarea și supraviețuirea organismelor nevizate, cum ar fi amfibienii.
Amfibienii devin din ce în ce mai importanți în evaluarea matricilor de mediu. Anuranii sunt considerați bioindicatori buni ai poluanților de mediu datorită caracteristicilor lor unice, cum ar fi ciclurile de viață complexe, ratele rapide de creștere larvară, starea trofică, pielea permeabilă10,11, dependența de apă pentru reproducere12 și ouăle neprotejate11,13,14. Broasca mică de apă (Physalaemus gracilis), cunoscută în mod obișnuit sub numele de broasca plângătoare, s-a dovedit a fi o specie bioindicatoare a poluării cu pesticide4,5,6,7,15. Specia se găsește în ape stătătoare, zone protejate sau zone cu habitat variabil din Argentina, Uruguay, Paraguay și Brazilia1617 și este considerată stabilă conform clasificării IUCN datorită distribuției sale largi și toleranței la diferite habitate18.
Efecte subletale au fost raportate la amfibieni în urma expunerii la cipermetrină, inclusiv modificări comportamentale, morfologice și biochimice la mormoloci23,24,25, modificarea mortalității și a timpului de metamorfoză, modificări enzimatice, scăderea succesului de eclozare24,25, hiperactivitate26, inhibarea activității colinesterazei27 și modificări ale performanței de înot7,28. Cu toate acestea, studiile privind efectele genotoxice ale cipermetrinei la amfibieni sunt limitate. Prin urmare, este important să se evalueze susceptibilitatea speciilor de anurani la cipermetrină.
Poluarea mediului afectează creșterea și dezvoltarea normală a amfibienilor, dar cel mai grav efect advers este deteriorarea genetică a ADN-ului cauzată de expunerea la pesticide13. Analiza morfologiei celulelor sanguine este un bioindicator important al poluării și al toxicității potențiale a unei substanțe pentru speciile sălbatice29. Testul micronuclear este una dintre cele mai frecvent utilizate metode pentru determinarea genotoxicității substanțelor chimice din mediu30. Este o metodă rapidă, eficientă și ieftină, care este un bun indicator al poluării chimice a organismelor precum amfibienii31,32 și poate oferi informații despre expunerea la poluanți genotoxici33.
Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua potențialul toxic al formulărilor comerciale de cipermetrină asupra mormolocilor acvatici mici, utilizând un test micronucleu și o evaluare a riscului ecologic.
Mortalitatea cumulată (%) a mormolocilor de P. gracilis expuși la diferite concentrații de cipermetrină comercială în perioada acută a testului.
Mortalitatea cumulată (%) a mormolocilor de P. gracilis expuși la diferite concentrații de cipermetrină comercială în timpul unui test cronic.
Mortalitatea ridicată observată a fost rezultatul efectelor genotoxice la amfibienii expuși la diferite concentrații de cipermetrină (6 și 20 μg/L), evidențiate de prezența micronucleilor (MN) și a anomaliilor nucleare în eritrocite. Formarea MN indică erori în mitoză și este asociată cu legarea deficitară a cromozomilor la microtubuli, defecte în complexele proteice responsabile de absorbția și transportul cromozomilor, erori în segregarea cromozomilor și erori în repararea deteriorării ADN-ului38,39 și poate fi legată de stresul oxidativ indus de pesticide40,41. Alte anomalii au fost observate la toate concentrațiile evaluate. Creșterea concentrațiilor de cipermetrină a crescut anomaliile nucleare în eritrocite cu 5% și 20% la cele mai mici (1 μg/L) și, respectiv, la cele mai mari (20 μg/L). De exemplu, modificările ADN-ului unei specii pot avea consecințe grave atât pentru supraviețuirea pe termen scurt, cât și pentru cea pe termen lung, rezultând în declinul populației, alterarea capacității reproductive, consangvinizare, pierderea diversității genetice și alterarea ratelor de migrație. Toți acești factori pot afecta supraviețuirea și menținerea speciilor42,43. Formarea anomaliilor eritroide poate indica un blocaj al citokinezei, rezultând o diviziune celulară anormală (eritrocite binucleate)44,45; nucleii multilobați sunt proeminențe ale membranei nucleare cu lobi multipli46, în timp ce alte anomalii eritroide pot fi asociate cu amplificarea ADN-ului, cum ar fi rinichii/veziculele nucleare47. Prezența eritrocitelor anucleate poate indica un transport afectat de oxigen, în special în apa contaminată48,49. Apoptoza indică moartea celulară50.
Alte studii au demonstrat, de asemenea, efectele genotoxice ale cipermetrinei. Kabaña și colab.51 au demonstrat prezența micronucleilor și a modificărilor nucleare, cum ar fi celule binucleate și celule apoptotice, în celulele Odontophrynus americanus după expunerea la concentrații mari de cipermetrină (5000 și 10.000 μg L−1) timp de 96 de ore. Apoptoza indusă de cipermetrină a fost detectată și la P. biligonigerus52 și Rhinella arenarum53. Aceste rezultate sugerează că cipermetrina are efecte genotoxice asupra unei game de organisme acvatice și că testul MN și ENA poate fi un indicator al efectelor subletale asupra amfibienilor și poate fi aplicabil speciilor native și populațiilor sălbatice expuse la substanțe toxice12.
Formulările comerciale de cipermetrină prezintă un risc ridicat pentru mediu (atât acut, cât și cronic), cu concentrații ridicate care depășesc nivelul Agenției pentru Protecția Mediului din SUA (EPA)54 și care pot afecta negativ specia dacă sunt prezente în mediu. În evaluarea riscului cronic, NOEC pentru mortalitate a fost de 3 μg L−1, confirmând că concentrațiile găsite în apă pot reprezenta un risc pentru specie55. NOEC letală pentru larvele de R. arenarum expuse la un amestec de endosulfan și cipermetrină a fost de 500 μg L−1 după 168 de ore; această valoare a scăzut la 0,0005 μg L−1 după 336 de ore. Autorii arată că, cu cât expunerea este mai lungă, cu atât sunt mai mici concentrațiile dăunătoare speciei. De asemenea, este important de subliniat faptul că valorile NOEC au fost mai mari decât cele ale P. gracilis la același timp de expunere, indicând faptul că răspunsul speciei la cipermetrină este specific speciei. În plus, în ceea ce privește mortalitatea, valoarea CHQ a P. gracilis după expunerea la cipermetrină a atins 64,67, ceea ce este mai mare decât valoarea de referință stabilită de Agenția pentru Protecția Mediului din SUA54, iar valoarea CHQ a larvelor de R. arenarum a fost, de asemenea, mai mare decât această valoare (CHQ > 388,00 după 336 de ore), indicând faptul că insecticidele studiate prezintă un risc ridicat pentru mai multe specii de amfibieni. Având în vedere că P. gracilis necesită aproximativ 30 de zile pentru a finaliza metamorfoza56, se poate concluziona că concentrațiile studiate de cipermetrină pot contribui la declinul populației prin împiedicarea indivizilor infectați să intre în stadiul adult sau reproductiv la o vârstă fragedă.
În evaluarea calculată a riscului de micronuclei și alte anomalii nucleare ale eritrocitelor, valorile CHQ au variat între 14,92 și 97,00, indicând faptul că cipermetrina prezenta un risc genotoxic potențial pentru P. gracilis chiar și în habitatul său natural. Ținând cont de mortalitate, concentrația maximă de compuși xenobiotici tolerabili pentru P. gracilis a fost de 4,24 μg L−1. Cu toate acestea, concentrații de până la 1 μg/L au prezentat, de asemenea, efecte genotoxice. Acest fapt poate duce la o creștere a numărului de indivizi anormali57 și poate afecta dezvoltarea și reproducerea speciilor în habitatele lor, ducând la un declin al populațiilor de amfibieni.
Formulările comerciale ale insecticidului cipermetrină au prezentat o toxicitate acută și cronică ridicată pentru P. gracilis. S-au observat rate de mortalitate mai mari, probabil din cauza efectelor toxice, evidențiate de prezența anomaliilor micronucleilor și ale nucleelor eritrocitare, în special nuclei serrați, nuclei lobați și nuclei veziculari. În plus, speciile studiate au prezentat riscuri de mediu crescute, atât acute, cât și cronice. Aceste date, combinate cu studii anterioare realizate de grupul nostru de cercetare, au arătat că, chiar și diferite formulări comerciale de cipermetrină au cauzat în continuare scăderea activității acetilcolinesterazei (AChE) și butirilcolinesterazei (BChE) și stres oxidativ58 și au dus la modificări ale activității de înot și malformații orale59 la P. gracilis, indicând faptul că formulările comerciale de cipermetrină au o toxicitate letală și subletală ridicată pentru această specie. Hartmann și colab.60 au descoperit că formulările comerciale de cipermetrină au fost cele mai toxice pentru P. gracilis și o altă specie din același gen (P. cuvieri) în comparație cu alte nouă pesticide. Acest lucru sugerează că concentrațiile de cipermetrină aprobate legal pentru protecția mediului pot duce la o mortalitate ridicată și la un declin al populației pe termen lung.
Sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua toxicitatea pesticidului asupra amfibienilor, deoarece concentrațiile găsite în mediu pot provoca o mortalitate ridicată și pot reprezenta un risc potențial pentru P. gracilis. Cercetarea asupra speciilor de amfibieni ar trebui încurajată, deoarece datele despre aceste organisme sunt puține, în special despre speciile braziliene.
Testul de toxicitate cronică a durat 168 de ore (7 zile) în condiții statice, iar concentrațiile subletale au fost: 1, 3, 6 și 20 μg ai L−1. În ambele experimente, au fost evaluați 10 mormoloci per grup de tratament cu șase replicări, pentru un total de 60 de mormoloci per concentrație. Între timp, tratamentul doar cu apă a servit drept control negativ. Fiecare configurație experimentală a constat dintr-un vas steril de sticlă cu o capacitate de 500 ml și o densitate de 1 mormoloc la 50 ml de soluție. Balonul a fost acoperit cu folie de polietilenă pentru a preveni evaporarea și a fost aerat continuu.
Apa a fost analizată chimic pentru a determina concentrațiile de pesticide la 0, 96 și 168 de ore. Conform lui Sabin și colab. 68 și Martins și colab. 69, analizele au fost efectuate la Laboratorul de Analiză a Pesticidelor (LARP) al Universității Federale din Santa Maria utilizând cromatografie gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă triplă cuadrupolă (Varian model 1200, Palo Alto, California, SUA). Determinarea cantitativă a pesticidelor din apă este prezentată ca material suplimentar (Tabelul SM1).
Pentru testul micronucleului (MNT) și testul anomaliei nucleare a eritrocitelor (ARN), au fost analizați 15 mormoloci din fiecare grup de tratament. Mormolocii au fost anesteziați cu lidocaină 5% (50 mg g-170), iar probele de sânge au fost colectate prin puncție cardiacă folosind seringi heparinate de unică folosință. Frotiurile de sânge au fost preparate pe lame sterile de microscop, uscate la aer, fixate cu metanol 100% (4 °C) timp de 2 minute și apoi colorate cu soluție Giemsa 10% timp de 15 minute la întuneric. La sfârșitul procesului, lamele au fost spălate cu apă distilată pentru a îndepărta excesul de colorant și uscate la temperatura camerei.
Cel puțin 1000 de eritrocite (RBC) din fiecare mormoloc au fost analizate folosind un microscop de 100× cu un obiectiv de 71 pentru a determina prezența MN și ENA. Un total de 75.796 de eritrocite din mormoloci au fost evaluate, luând în considerare concentrațiile de cipermetrină și controalele. Genotoxicitatea a fost analizată conform metodei Carrasco și colab. și Fenech și colab.38,72 prin determinarea frecvenței următoarelor leziuni nucleare: (1) celule anucleate: celule fără nucleu; (2) celule apoptotice: fragmentare nucleară, moarte celulară programată; (3) celule binucleate: celule cu doi nuclei; (4) muguri nucleari sau celule bleb: celule cu nuclei cu mici proeminențe ale membranei nucleare, bleb-uri similare ca dimensiuni cu micronucleii; (5) celule cariolizate: celule cu doar conturul nucleului, fără material intern; (6) celule crestate: celule cu nuclei cu fisuri sau crestături evidente în formă, numite și nuclei în formă de reni; (7) celule lobulate: celule cu proeminențe nucleare mai mari decât veziculele menționate anterior; și (8) microcelule: celule cu nuclei condensați și citoplasmă redusă. Modificările au fost comparate cu rezultatele controlului negativ.
Rezultatele testelor de toxicitate acută (LC50) au fost analizate utilizând software-ul GBasic și metoda TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Datele testelor cronice au fost pre-testate pentru normalitatea erorii (Shapiro-Wilks) și omogenitatea varianței (Bartlett). Rezultatele au fost analizate utilizând analiza varianței într-o singură direcție (ANOVA). Testul Tukey a fost utilizat pentru a compara datele între ele, iar testul Dunnett a fost utilizat pentru a compara datele între grupul de tratament și grupul de control negativ.
Datele LOEC și NOEC au fost analizate folosind testul Dunnett. Testele statistice au fost efectuate folosind software-ul Statistica 8.0 (StatSoft) cu un nivel de semnificație de 95% (p < 0,05).
Data publicării: 13 martie 2025