Materiale vegetale și patogene
O populație de cartografiere a asocierilor de sorg, cunoscută sub numele de populație de conversie a sorgului (SCP), a fost furnizată de Dr. Pat Brown de la Universitatea din Illinois (acum la UC Davis). Aceasta a fost descrisă anterior și este o colecție de linii diverse convertite la insensibilitate la fotoperioadă și statură mai mică pentru a facilita creșterea și dezvoltarea plantelor în mediile din SUA. În acest studiu au fost utilizate 510 linii din această populație, deși, din cauza germinării slabe și a altor probleme de control al calității, nu toate liniile au fost utilizate în analiza tuturor celor trei trăsături. În cele din urmă, date de la 345 de linii au fost utilizate pentru analiza răspunsului la chitină, 472 de linii pentru răspunsul la flg22 și 456 pentru rezistența la TLS.B. cookeiTulpina LSLP18 a fost obținută de la Dr. Burt Bluhm de la Universitatea din Arkansas.
Măsurarea răspunsului MAMP
În acest studiu s-au utilizat două MAMP-uri diferite flg22 (catalog Genscript nr. RP19986) și chitină. Plantele de sorg au fost cultivate în inserții așezate pe suprafețe plate umplute cu sol (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) în seră. Plantele au fost udate cu o zi înainte de colectarea probei pentru a evita umiditatea suplimentară a frunzelor în ziua colectării.
Liniile au fost randomizate și, din motive logistice, au fost plantate în loturi de câte 60 de linii. Pentru fiecare linie, au fost plantate trei „ghivece” cu câte două semințe pe linie. Loturile ulterioare au fost plantate imediat ce lotul anterior a fost procesat, până când întreaga populație a fost evaluată. Au fost efectuate două experimente pentru ambele MAMP-uri, cu genotipuri re-randomizate în fiecare dintre cele două experimente.
Testele ROS au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, pentru fiecare linie, șase semințe au fost plantate în 3 ghivece diferite. Din răsadurile rezultate, trei au fost selectate pe baza uniformității. Răsadurile care păreau neobișnuite sau erau semnificativ mai înalte sau mai scunde decât majoritatea nu au fost utilizate. Patru discuri de frunze cu diametrul de 3 mm au fost excizate din cea mai lată parte a celei de-a patra frunze a trei plante diferite de sorg, în vârstă de 15 zile. Un disc per frunză de la două plante și două discuri de la o plantă, al doilea disc devenind controlul apei (vezi mai jos). Discurile au fost plutite individual pe 50 µl de H20 într-o placă neagră cu 96 de godeuri, sigilate cu un sigiliu de aluminiu pentru a evita expunerea la lumină și păstrate la temperatura camerei peste noapte. În dimineața următoare, s-a preparat o soluție de reacție folosind sonda chemiluminiscentă L-012 (Wako, catalog # 120-04891) de 2 mg/ml, peroxidază de hrean de 2 mg/ml (tip VI-A, Sigma-Aldrich, catalog # P6782) și 100 mg/ml chitină sau 2 μM de Flg22. 50 µl din această soluție de reacție au fost adăugați în trei dintre cele patru godeuri. Al patrulea godeu a fost un control simulat, la care s-a adăugat soluția de reacție excluzând MAMP. În fiecare placă au fost incluse și patru godeuri goale conținând doar apă.
După adăugarea soluției de reacție, luminescența a fost măsurată utilizând cititorul de microplăci multi-detecție Synergy™ 2 (BioTek) la fiecare 2 minute timp de 1 oră. Cititorul de plăci efectuează măsurători de luminescență la fiecare 2 minute pe parcursul acestei ore. Suma tuturor celor 31 de citiri a fost calculată pentru a obține valoarea pentru fiecare godeu. Valoarea estimată pentru răspunsul MAMP pentru fiecare genotip a fost calculată ca (valoarea medie a luminescenței celor trei godeuri experimentale - valoarea godeului simulat) - minus valoarea medie a godeului gol. Valorile godeurilor gol au fost constant apropiate de zero.
Discuri de frunze deNicotiana benthamiana, o linie de sorg cu reactivitate ridicată (SC0003) și o linie de sorg cu reactivitate scăzută (PI 6069) au fost, de asemenea, incluse ca și controale în fiecare placă cu 96 de godeuri, în scopuri de control al calității.
B. cookeipregătirea și inocularea inoculului
B. cookeiInoculul a fost preparat așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, boabele de sorg au fost înmuiate în apă timp de trei zile, clătite, puse în baloane conice de 1 litru și autoclavizate timp de o oră la 15 psi și 121 °C. Boabele au fost apoi inoculate cu aproximativ 5 ml de micelii macerați dintr-o cultură proaspătă deB. cookeiIzolatele LSLP18 au fost lăsate timp de 2 săptămâni la temperatura camerei, agitând flacoanele la fiecare 3 zile. După 2 săptămâni, boabele de sorg infestate cu ciuperci au fost uscate la aer și apoi depozitate la 4 °C până la inocularea pe câmp. Același inocul a fost utilizat pentru întregul studiu și preparat proaspăt în fiecare an. Pentru inoculare, 6-10 boabe infestate au fost plasate în spirala plantelor de sorg cu vârsta de 4-5 săptămâni. Sporii produși de aceste ciuperci au inițiat infecția la plantele tinere de sorg în decurs de o săptămână.
Pregătirea semințelor
Înainte de plantarea în câmp, semințele de sorg au fost tratate cu un amestec de fungicid, insecticid și agent protectant, conținând ~ 1% fungicid Spirato 480 FS, 4% fungicid Sebring 480 FS și 3% agent protectant Sorpro 940 ES. Apoi, semințele au fost uscate la aer timp de 3 zile, ceea ce a asigurat un strat subțire din acest amestec în jurul semințelor. Agentul protectant a permis utilizarea erbicidului Dual Magnum ca tratament preemergent.
Evaluarea rezistenței la pătarea frunzelor țintă
SCP-ul a fost plantat la Stația Centrală de Cercetare a Culturilor din Clayton, NC, în perioadele 14-15 iunie 2017 și 20 iunie 2018, într-un design randomizat în blocuri complete, cu câte două replici experimentale în fiecare caz. Experimentele au fost plantate pe rânduri individuale de 1,8 m cu o lățime a rândurilor de 0,9 m, folosind 10 semințe per parcelă. Două rânduri de margine au fost plantate în jurul periferiei fiecărui experiment pentru a preveni efectele de margine. Experimentele au fost inoculate pe 20 iulie 2017 și 20 iulie 2018, moment în care plantele de sorg se aflau în stadiul de creștere 3. Evaluările au fost efectuate pe scale de la unu la nouă, unde plantele care nu prezentau semne de boală au fost evaluate cu nouă, iar plantele complet moarte au fost evaluate cu unu. Două evaluări au fost efectuate în 2017 și patru citiri în 2018, începând cu două săptămâni după inoculare în fiecare an. sAUDPC (aria standardizată de sub curba de progresie a bolii) a fost calculat așa cum s-a descris anterior.
Data publicării: 01 aprilie 2021