Nematodul pinului este un endoparazit migrator de carantină, cunoscut pentru faptul că provoacă pierderi economice severe în ecosistemele pădurilor de pin. Prezentul studiu analizează activitatea nematicidă a indolilor halogenați împotriva nematodelor de pin și mecanismul lor de acțiune. Activitățile nematicide ale 5-iodoindolului și avermectinei (control pozitiv) împotriva nematodelor de pin au fost similare și ridicate la concentrații scăzute (10 μg/mL). 5-iodoindolul a redus fecunditatea, activitatea reproductivă, mortalitatea embrionară și larvară și comportamentul locomotor. Interacțiunile moleculare ale liganzilor cu receptorii canalelor de clorură cu funcție de glutamat specifici nevertebratelor susțin ideea că 5-iodoindolul, la fel ca avermectina, se leagă strâns de situsul activ al receptorului. 5-iodoindolul a indus, de asemenea, diverse deformări fenotipice la nematode, inclusiv colaps/contracție anormală a organelor și vacuolizare crescută. Aceste rezultate sugerează că vacuolele pot juca un rol în moartea mediată de metilarea nematodelor. Este important de menționat că 5-iodoindolul nu a fost toxic pentru ambele specii de plante (varză și ridiche). Astfel, acest studiu demonstrează că aplicarea iodoindolului în condiții de mediu poate controla leziunile cauzate de ofilirea pinului.
Nematoda lemnului de pin (Bursaphelenchus xylophilus) aparține nematodelor lemnului de pin (PWN), nematode endoparazitare migratoare cunoscute pentru faptul că provoacă daune ecologice grave ecosistemelor pădurilor de pin1. Boala ofilirii pinului (PWD) cauzată de nematoda lemnului de pin devine o problemă serioasă pe mai multe continente, inclusiv în Asia și Europa, iar în America de Nord, nematoda distruge speciile de pin introduse1,2. Declinul pinilor este o problemă economică majoră, iar perspectiva răspândirii sale la nivel global este îngrijorătoare3. Următoarele specii de pin sunt cel mai frecvent atacate de nematodă: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii și Pinus radiata4. Nematoda pinului este o boală gravă care poate ucide pinii în câteva săptămâni sau luni de la infecție. În plus, focarele de nematode ale pinului sunt frecvente într-o varietate de ecosisteme, astfel încât s-au stabilit lanțuri de infecție persistente1.
Bursaphelenchus xylophilus este o nematodă parazită a plantelor de carantină, aparținând superfamiliei Aphelenchoidea și cladei 102.5. Nematoda se hrănește cu ciuperci și se reproduce în țesuturile lemnoase ale pinilor, dezvoltându-se în patru stadii larvare diferite: L1, L2, L3, L4 și un individ adult1,6. În condiții de deficit de hrană, nematoda pinului trece într-un stadiu larvar specializat – dauer, care parazitează vectorul său – gândacul de scoarță de pin (Monochamus alternatus) și este transferată la pini sănătoși. La gazdele sănătoase, nematodele migrează rapid prin țesuturile plantelor și se hrănesc cu celule parenchimatoase, ceea ce duce la o serie de reacții de hipersensibilitate, ofilirea și moartea pinului în decurs de un an de la infecție1,7,8.
Controlul biologic al nematodelor de pin a reprezentat mult timp o provocare, măsurile de carantină datând din secolul al XX-lea. Strategiile actuale de control al nematodelor de pin implică în principal tratamente chimice, inclusiv fumigația lemnului și implantarea de nematocide în trunchiurile copacilor. Cele mai frecvent utilizate nematocide sunt avermectina și benzoatul de avermectină, care aparțin familiei avermectinelor. Aceste substanțe chimice scumpe sunt extrem de eficiente împotriva multor specii de nematode și sunt considerate sigure pentru mediu9. Cu toate acestea, se așteaptă ca utilizarea repetată a acestor nematocide să creeze o presiune de selecție care va duce aproape sigur la apariția unor nematode de pin rezistente, așa cum s-a demonstrat pentru mai mulți dăunători ai insectelor, cum ar fi Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella și nematodele Trichostrongylus colubriformis și Ostertagia circumcincta, care au dezvoltat treptat rezistență la avermectine10,11,12. Prin urmare, modelele de rezistență trebuie studiate în mod regulat, iar nematocidele trebuie analizate continuu pentru a găsi măsuri alternative, eficiente din punct de vedere al costurilor și ecologice pentru a controla decesul papilelor vegetative (PVD). În ultimele decenii, o serie de autori au propus utilizarea extractelor de plante, a uleiurilor esențiale și a substanțelor volatile ca agenți de control al nematozilor13,14,15,16.
Recent, am demonstrat activitatea nematicidă a indolului, o moleculă de semnalizare intercelulară și interregni, la Caenorhabditis elegans 17. Indolul este un semnal intracelular răspândit în ecologia microbiană, controlând numeroase funcții care afectează fiziologia microbiană, formarea sporilor, stabilitatea plasmidelor, rezistența la medicamente, formarea biofilmului și virulența 18, 19. Activitatea indolului și a derivaților săi împotriva altor nematode patogene nu a fost studiată. În acest studiu, am investigat activitatea nematicidă a 34 de indoli împotriva nematodelor de pin și am elucidat mecanismul de acțiune al celui mai puternic 5-iodoindol folosind microscopia, fotografia time-lapse și experimente de andocare moleculară și am evaluat efectele sale toxice asupra plantelor folosind un test de germinare a semințelor.
Concentrații mari (>1,0 mM) de indol au fost raportate anterior ca având un efect nematicid asupra nematodelor17. În urma tratamentului B. xylophilus (stadii de viață mixte) cu indol sau 33 de derivați diferiți de indol la 1 mM, mortalitatea B. xylophilus a fost măsurată prin numărarea nematodelor vii și moarte din grupurile de control și tratat. Cinci indoli au prezentat o activitate nematicidă semnificativă; supraviețuirea grupului de control netratat a fost de 95 ± 7% după 24 de ore. Dintre cei 34 de indoli testați, 5-iodoindolul și 4-fluoroindolul la 1 mM au cauzat o mortalitate de 100%, în timp ce 5,6-difluoroindigo, metil-7-carboxilatul și 7-iodoindolul au cauzat o mortalitate de aproximativ 50% (Tabelul 1).
Efectul 5-iodoindolului asupra formării vacuolelor și metabolismului nematodei lemnului de pin. (A) Efectul avermectinei și 5-iodoindolului asupra nematodelor masculi adulți, (B) ouă de nematod în stadiul L1 și (C) metabolismul B. xylophilus, (i) vacuolele nu au fost observate la 0 h, tratamentul a dus la (ii) vacuole, (iii) acumularea de vacuole multiple, (iv) umflarea vacuolelor, (v) fuziunea vacuolelor și (vi) formarea de vacuole gigantice. Săgețile roșii indică umflarea vacuolelor, săgețile albastre indică fuziunea vacuolelor, iar săgețile negre indică vacuole gigantice. Bara de scală = 50 μm.
În plus, acest studiu a descris și procesul secvențial al morții induse de metan la nematodele de pin (Figura 4C). Moartea metanogenă este un tip non-apoptotic de moarte celulară asociat cu acumularea de vacuole citoplasmatice proeminente27. Defectele morfologice observate la nematodele de pin par a fi strâns legate de mecanismul morții induse de metan. Examinarea microscopică la momente diferite a arătat că s-au format vacuole gigantice după 20 de ore de expunere la 5-iodoindol (0,1 mM). Vacuole microscopice au fost observate după 8 ore de tratament, iar numărul lor a crescut după 12 ore. Mai multe vacuole mari au fost observate după 14 ore. Mai multe vacuole fuzionate au fost clar vizibile după 12-16 ore de tratament, indicând faptul că fuziunea vacuolelor este baza mecanismului morții metanogene. După 20 de ore, s-au găsit mai multe vacuole gigantice în întregul vierme. Aceste observații reprezintă primul raport de metuoză la C. elegans.
La viermii tratați cu 5-iodoindol, s-au observat, de asemenea, agregarea și ruptura vacuolelor (Fig. 5), evidențiate prin îndoirea viermilor și eliberarea vacuolelor în mediu. De asemenea, s-a observat perturbarea vacuolelor în membrana cojii ouălor, care este în mod normal păstrată intactă de L2 în timpul ecloziunii (Fig. suplimentară S2). Aceste observații susțin implicarea acumulării de fluide și a insuficienței osmoreglatoare, precum și a leziunilor celulare reversibile (RCI), în procesul de formare și supurație a vacuolelor (Fig. 5).
Emițând ipoteza rolului iodului în formarea vacuolelor observate, am investigat activitatea nematicidă a iodurii de sodiu (NaI) și a iodurii de potasiu (KI). Cu toate acestea, la concentrații (0,1, 0,5 sau 1 mM), acestea nu au afectat nici supraviețuirea nematodelor, nici formarea vacuolelor (Fig. suplimentară S5), deși 1 mM KI a avut un ușor efect nematicid. Pe de altă parte, 7-iodoindolul (1 sau 2 mM), la fel ca 5-iodoindolul, a indus multiple vacuole și deformări structurale (Fig. suplimentară S6). Cele două iodoindole au prezentat caracteristici fenotipice similare la nematodele de pin, în timp ce NaI și KI nu au făcut-o. Interesant este că indolul nu a indus formarea de vacuole la B. xylophilus la concentrațiile testate (datele nu sunt prezentate). Astfel, rezultatele au confirmat că complexul indol-iod este responsabil pentru vacuolizarea și metabolismul B. xylophilus.
Printre indolii testați pentru activitate nematicidă, 5-iodoindolul a avut cel mai mare indice de alunecare, de -5,89 kcal/mol, urmat de 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) și indol (-4,03) (Figura 6). Legătura puternică de hidrogen a catenei principale dintre 5-iodoindol și leucina 218 stabilizează legarea acestuia, în timp ce toți ceilalți derivați de indol se leagă de serina 260 prin legături de hidrogen în lanțul lateral. Printre alți iodoindoli modelați, 2-iodoindolul are o valoare de legare de -5,248 kcal/mol, care se datorează principalei sale legături de hidrogen cu leucina 218. Alte legături cunoscute includ 3-iodoindolul (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindolul (-4,0 kcal/mol) și 6-fluoroindolul (-2,6 kcal/mol) (Figura suplimentară S8). Majoritatea indolilor halogenați și indolul în sine, cu excepția 5-iodoindolului și 2-iodoindolului, formează o legătură cu serina 260. Faptul că legătura de hidrogen cu leucina 218 indică o legare eficientă receptor-ligand, așa cum s-a observat pentru ivermectină (Fig. suplimentară S7), confirmă faptul că 5-iodoindolul și 2-iodoindolul, la fel ca ivermectina, se leagă strâns de situsul activ al receptorului GluCL prin intermediul leucinei 218 (Fig. 6 și Fig. suplimentară S8). Propunem că această legare este necesară pentru a menține structura cu pori deschiși a complexului GluCL și că, prin legarea strânsă de situsul activ al receptorului GluCL, 5-iodoindolul, 2-iodoindolul, avermectina și ivermectina mențin astfel canalul ionic deschis și permit absorbția fluidelor.
Legătura moleculară a indolului și indolului halogenat la GluCL. Orientările de legare ale liganzilor (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol și (D) 5-iodoindol la situsul activ al GluCL. Proteina este reprezentată de o panglică, iar legăturile de hidrogen ale catenei principale sunt arătate ca linii punctate galbene. (A′), (B′), (C′) și (D′) prezintă interacțiunile liganzilor corespunzători cu reziduurile de aminoacizi înconjurătoare, iar legăturile de hidrogen ale lanțului lateral sunt indicate prin săgeți punctate roz.
Au fost efectuate experimente pentru a evalua efectul toxic al 5-iodoindolului asupra germinării semințelor de varză și ridiche. 5-iodoindolul (0,05 sau 0,1 mM) sau avermectina (10 μg/mL) au avut un efect redus sau inexistent asupra germinării inițiale și a răsăririi plantulelor (Figura 7). În plus, nu s-a constatat nicio diferență semnificativă între rata de germinare a semințelor de control netratate și cea tratată cu 5-iodoindol sau avermectină. Efectul asupra alungirii rădăcinii pivotante și a numărului de rădăcini laterale formate a fost nesemnificativ, deși 1 mM (de 10 ori concentrația sa activă) de 5-iodoindol a întârziat ușor dezvoltarea rădăcinilor laterale. Aceste rezultate indică faptul că 5-iodoindolul este netoxic pentru celulele plantelor și nu interferează cu procesele de dezvoltare a plantelor la concentrațiile studiate.
Efectul 5-iodoindolului asupra germinării semințelor. Germinarea, încolțirea și înrădăcinarea laterală a semințelor de B. oleracea și R. raphanistrum pe mediu de agar Murashige și Skoog cu sau fără avermectină sau 5-iodoindol. Germinarea a fost înregistrată după 3 zile de incubare la 22°C.
Acest studiu raportează mai multe cazuri de ucidere a nematozilor de către indoli. Este important de menționat că acesta este primul raport despre metilarea indusă de iodoindol (un proces cauzat de acumularea de vacuole mici care se contopesc treptat în vacuole gigantice, ducând în cele din urmă la ruptura membranei și moartea acesteia) în acele de pin, iodoindolul prezentând proprietăți nematicide semnificative, similare cu cele ale nematicidului comercial avermectină.
Anterior, s-a raportat că indolii exercită multiple funcții de semnalizare la procariote și eucariote, inclusiv inhibarea/formarea biofilmului, supraviețuirea bacteriilor și patogenitatea19,32,33,34. Recent, potențialele efecte terapeutice ale indolilor halogenați, alcaloizilor indolici și derivaților semisintetici de indol au atras un interes extins în cercetare35,36,37. De exemplu, s-a demonstrat că indolii halogenați distrug celulele persistente de Escherichia coli și Staphylococcus aureus37. În plus, este de interes științific studierea eficacității indolilor halogenați împotriva altor specii, genuri și regnuri, iar acest studiu este un pas către atingerea acestui obiectiv.
Aici, propunem un mecanism pentru letalitatea indusă de 5-iodoindol la C. elegans, bazat pe leziuni celulare reversibile (RCI) și metilare (Figurile 4C și 5). Modificările edematoase, cum ar fi umflarea și degenerarea vacuolară, sunt indicatori ai RCI și metilației, manifestate ca vacuole gigantice în citoplasmă48,49. RCI interferează cu producția de energie prin reducerea producției de ATP, provocând defectarea pompei ATPază sau perturbând membranele celulare și provocând un aflux rapid de Na+, Ca2+ și apă50,51,52. Vacuolele intracitoplasmatice apar în celulele animale ca urmare a acumulării de lichid în citoplasmă datorită afluxului de Ca2+ și apă53. Interesant este că acest mecanism de deteriorare celulară este reversibil dacă deteriorarea este temporară și celulele încep să producă ATP pentru o anumită perioadă de timp, dar dacă deteriorarea persistă sau se agravează, celulele mor.54 Observațiile noastre arată că nematodele tratate cu 5-iodoindol nu sunt capabile să restabilească biosinteza normală după expunerea la condiții de stres.
Fenotipul de metilare indus de 5-iodoindol în B. xylophilus se poate datora prezenței iodului și distribuției sale moleculare, deoarece 7-iodoindolul a avut un efect inhibitor mai mic asupra B. xylophilus decât 5-iodoindolul (Tabelul 1 și Figura suplimentară S6). Aceste rezultate sunt parțial în concordanță cu studiile realizate de Maltese și colab. (2014), care au raportat că translocarea grupării de azot piridilic în indol din poziția para în poziția meta a abolit vacuolizarea, inhibarea creșterii și citotoxicitatea în celulele U251, sugerând că interacțiunea moleculei cu un situs activ specific din proteină este critică27,44,45. Interacțiunile dintre indol sau indoli halogenați și receptorii GluCL observate în acest studiu susțin, de asemenea, această noțiune, deoarece s-a constatat că 5- și 2-iodoindolul se leagă de receptorii GluCL mai puternic decât ceilalți indoli examinați (Figura 6 și Figura suplimentară S8). S-a constatat că iodul din a doua sau a cincea poziție a indolului se leagă de leucina 218 a receptorului GluCL prin legături de hidrogen de la catena principală, în timp ce alți indoli halogenați și indolul în sine formează legături de hidrogen slabe pe lanțul lateral cu serina 260 (Figura 6). Prin urmare, speculăm că localizarea halogenului joacă un rol important în inducerea degenerării vacuolare, în timp ce legarea strânsă a 5-iodoindolului menține canalul ionic deschis, permițând astfel un aflux rapid de fluide și ruptura vacuolei. Cu toate acestea, mecanismul detaliat de acțiune al 5-iodoindolului rămâne de determinat.
Înainte de aplicarea practică a 5-iodoindolului, trebuie analizat efectul său toxic asupra plantelor. Experimentele noastre de germinare a semințelor au arătat că 5-iodoindolul nu a avut niciun efect negativ asupra germinării semințelor sau asupra proceselor ulterioare de dezvoltare la concentrațiile studiate (Figura 7). Astfel, acest studiu oferă o bază pentru utilizarea 5-iodoindolului în mediul ecologic pentru a controla nocivitatea nematodelor de pin pentru pini.
Rapoartele anterioare au demonstrat că terapia pe bază de indol reprezintă o abordare potențială pentru a aborda problema rezistenței la antibiotice și a progresiei cancerului55. În plus, indolii posedă activități antibacteriene, anticancerigene, antioxidante, antiinflamatorii, antidiabetice, antivirale, antiproliferative și antituberculoase și pot servi drept bază promițătoare pentru dezvoltarea de medicamente56,57. Acest studiu sugerează pentru prima dată utilizarea potențială a iodului ca agent antiparazitar și antihelmintic.
Avermectina a fost descoperită în urmă cu trei decenii și a câștigat Premiul Nobel în 2015, iar utilizarea sa ca antihelmintic este încă în desfășurare. Cu toate acestea, din cauza dezvoltării rapide a rezistenței la avermectine la nematode și insecte dăunătoare, este necesară o strategie alternativă, ieftină și ecologică pentru a controla infecția cu PWN la pini. Acest studiu prezintă, de asemenea, mecanismul prin care 5-iodoindolul ucide nematodele pinului și faptul că 5-iodoindolul are o toxicitate scăzută pentru celulele plantelor, ceea ce deschide perspective bune pentru aplicarea sa comercială viitoare.
Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de Etică al Universității Yeungnam, Gyeongsan, Coreea, iar metodele au fost efectuate în conformitate cu directivele Comitetului de Etică al Universității Yeungnam.
Experimentele de incubare a ouălor au fost efectuate folosind proceduri stabilite43. Pentru a evalua ratele de eclozare (HR), nematode adulte în vârstă de 1 zi (aproximativ 100 de femele și 100 de masculi) au fost transferate în vase Petri care conțineau ciuperca și lăsate să crească timp de 24 de ore. Ouăle au fost apoi izolate și tratate cu 5-iodoindol (0,05 mM și 0,1 mM) sau avermectină (10 μg/ml) sub formă de suspensie în apă distilată sterilă. Aceste suspensii (500 μl; aproximativ 100 de ouă) au fost transferate în godeurile unei plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri și incubate la 22 °C. Numărările L2 au fost efectuate după 24 de ore de incubare, dar au fost considerate moarte dacă celulele nu se mișcau atunci când erau stimulate cu un fir fin de platină. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare cu șase repetiții. Datele din ambele experimente au fost combinate și prezentate. Procentul de HR se calculează după cum urmează:
Mortalitatea larvară a fost evaluată folosind proceduri dezvoltate anterior. Ouăle de nematode au fost colectate, iar embrionii au fost sincronizați prin eclozare în apă distilată sterilă pentru a genera larve în stadiul L2. Larvele sincronizate (aproximativ 500 de nematode) au fost tratate cu 5-iodoindol (0,05 mM și 0,1 mM) sau avermectină (10 μg/ml) și crescute pe plăci Petri cu B. cinerea. După 48 de ore de incubare la 22 °C, nematodele au fost colectate în apă distilată sterilă și examinate pentru prezența stadiilor L2, L3 și L4. Prezența stadiilor L3 și L4 a indicat transformarea larvară, în timp ce prezența stadiului L2 nu a indicat nicio transformare. Imaginile au fost achiziționate folosind sistemul de imagistică celulară digitală iRiS™. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare cu șase repetiții. Datele din ambele experimente au fost combinate și prezentate.
Toxicitatea 5-iodoindolului și avermectinei asupra semințelor a fost evaluată utilizând teste de germinare pe plăci de agar Murashige și Skoog.62 Semințe de B. oleracea și R. raphanistrum au fost mai întâi înmuiate în apă distilată sterilă timp de o zi, spălate cu 1 ml etanol 100%, sterilizate cu 1 ml înălbitor comercial 50% (3% hipoclorit de sodiu) timp de 15 minute și spălate de cinci ori cu 1 ml apă sterilă. Semințele sterilizate au fost apoi presate pe plăci de agar pentru germinare conținând 0,86 g/l (0,2X) mediu Murashige și Skoog și 0,7% agar bacteriologic cu sau fără 5-iodoindol sau avermectină. Plăcile au fost apoi incubate la 22 °C, iar imaginile au fost realizate după 3 zile de incubare. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare având șase repetiții.
Data publicării: 26 februarie 2025