Nematodul pinului este un endoparazit migrator de carantină cunoscut că provoacă pierderi economice grave în ecosistemele pădurilor de pin. Prezentul studiu analizează activitatea nematicidă a indolilor halogenați împotriva nematozilor de pin și mecanismul lor de acțiune. Activitățile nematicide ale 5-iodoindolului și ale avermectinei (martor pozitiv) împotriva nematozilor de pin au fost similare și ridicate la concentrații scăzute (10 μg/mL). 5-iodoindolul a redus fecunditatea, activitatea reproductivă, mortalitatea embrionară și larvară și comportamentul locomotor. Interacțiunile moleculare ale liganzilor cu receptorii canalului de clorură determinați pentru glutamat specifici nevertebratelor susțin ideea că 5-iodoindol, ca și avermectina, se leagă strâns de situsul activ al receptorului. 5-Iodoindolul a indus, de asemenea, diverse deformări fenotipice la nematozi, inclusiv colapsul/contracția anormală a organelor și vacuolizarea crescută. Aceste rezultate sugerează că vacuolele pot juca un rol în moartea mediată de metilarea nematozilor. Important este că 5-iodoindolul nu a fost toxic pentru ambele specii de plante (varză și ridichi). Astfel, acest studiu demonstrează că aplicarea iodoindolului în condiții de mediu poate controla vătămarea ofilită a pinului.
Nematodul lemnului de pin (Bursaphelenchus xylophilus) aparține nematozilor lemnului de pin (PWN), nematozi endoparaziți migratori despre care se știe că provoacă daune ecologice grave ecosistemelor pădurilor de pin1. Boala ofilirii pinului (PWD) cauzată de nematodul lemnului de pin devine o problemă serioasă pe mai multe continente, inclusiv Asia și Europa, iar în America de Nord, nematodul distruge speciile de pin introduse1,2. Declinul pinilor este o problemă economică majoră, iar perspectiva răspândirii sale la nivel global este îngrijorătoare3. Următoarele specii de pin sunt cel mai frecvent atacate de nematod: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii și Pinus radiata4. Nematodul pinului este o boală gravă care poate ucide pinii în câteva săptămâni sau luni de la infectare. În plus, focarele de nematozi de pin sunt frecvente într-o varietate de ecosisteme, astfel încât au fost stabilite lanțuri de infecție persistente1.
Bursaphelenchus xylophilus este un nematod parazit al plantelor de carantină aparținând superfamiliei Aphelenchoidea și cladei 102.5. Nematodul se hrănește cu ciuperci și se reproduce în țesuturile lemnoase ale pinii, dezvoltându-se în patru stadii larvare diferite: L1, L2, L3, L4 și un individ adult1,6. În condiții de deficit de hrană, nematodul pinului trece într-un stadiu larvar specializat – dauer, care-și parazitează vectorul – gândacul de scoarță de pin (Monochamus alternatus) și este transferat la pini sănătoși. La gazdele sănătoase, nematozii migrează rapid prin țesuturile plantelor și se hrănesc cu celule parenchimatoase, ceea ce duce la o serie de reacții de hipersensibilitate, ofilirea pinului și moartea în decurs de un an de la infectare1,7,8.
Controlul biologic al nematozilor de pin a fost de multă vreme o provocare, măsurile de carantină datând din secolul al XX-lea. Strategiile actuale pentru controlul nematozilor de pin implică în primul rând tratamente chimice, inclusiv fumigarea lemnului și implantarea de nematicide în trunchiurile copacilor. Cele mai frecvent utilizate nematicide sunt avermectina și benzoatul de avermectină, care aparțin familiei avermectinelor. Aceste substanțe chimice scumpe sunt foarte eficiente împotriva multor specii de nematozi și sunt considerate sigure pentru mediu9. Cu toate acestea, utilizarea repetată a acestor nematicide este de așteptat să creeze o presiune de selecție care va duce aproape sigur la apariția nematozilor de pin rezistenți, așa cum s-a demonstrat pentru mai multe insecte dăunătoare, cum ar fi Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella și nematozii Trichostrongylus colubylus și Ostertagia circumcincta, care au dezvoltat treptat rezistență la avermeriformis101. Prin urmare, modelele de rezistență trebuie studiate în mod regulat și nematicidele verificate continuu pentru a găsi măsuri alternative, rentabile și ecologice pentru controlul PVD. În ultimele decenii, o serie de autori au propus utilizarea extractelor de plante, uleiurilor esențiale și volatilelor ca agenți de control al nematozilor13,14,15,16.
Recent am demonstrat activitatea nematicidă a indolului, o moleculă de semnalizare intercelulară și interregan, în Caenorhabditis elegans 17 . Indolul este un semnal intracelular larg răspândit în ecologia microbiană, controlând numeroase funcții care afectează fiziologia microbiană, formarea sporilor, stabilitatea plasmidei, rezistența la medicamente, formarea biofilmului și virulența 18, 19 . Activitatea indolului și a derivaților săi împotriva altor nematozi patogeni nu a fost studiată. În acest studiu, am investigat activitatea nematicidă a 34 de indoli împotriva nematodelor de pin și am elucidat mecanismul de acțiune al celui mai puternic 5-iodoindol folosind microscopie, fotografie în timp și experimente de andocare moleculară și am evaluat efectele toxice asupra plantelor folosind un test de germinare a semințelor.
S-a raportat anterior că concentrațiile mari (>1,0 mM) de indol au un efect nematicid asupra nematozilor17. În urma tratamentului B. xylophilus (stadii de viață mixte) cu indol sau 33 de derivați diferiți de indol la 1 mM, mortalitatea B. xylophilus a fost măsurată prin numărarea nematozilor vii și morți în grupurile martor și tratate. Cinci indoli au prezentat activitate nematicidă semnificativă; supraviețuirea grupului martor netratat a fost de 95 ± 7% după 24 de ore. Din cei 34 de indoli testați, 5-iodoindol și 4-fluoroindol la 1 mM au cauzat o mortalitate de 100%, în timp ce 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-carboxilat și 7-iodoindol au cauzat aproximativ 50% mortalitate (Tabelul 1).
Efectul 5-iodoindolului asupra formării vacuolelor și metabolismului nematodului lemnului de pin. (A) Efectul avermectinei și 5-iodoindolului asupra nematozilor de sex masculin adulți, (B) ouăle de nematod în stadiul L1 și (C) metabolismul B. xylophilus, (i) vacuolele nu au fost observate la 0 h, tratamentul a dus la (ii) vacuole, (iii) acumularea de mai multe vacuole, (iv) vacuole și puțuri de fuziune (vi) formarea de vacuole gigantice. Săgețile roșii indică umflarea vacuolelor, săgețile albastre indică fuziunea vacuolelor și săgețile negre indică vacuole gigantice. Bară de scară = 50 μm.
În plus, acest studiu a descris, de asemenea, procesul secvenţial de moarte indusă de metan la nematozii de pin (Figura 4C). Moartea metanogenă este un tip non-apoptotic de moarte celulară asociată cu acumularea de vacuole citoplasmatice proeminente27. Defectele morfologice observate la nematozii pinului par a fi strâns legate de mecanismul morții induse de metan. Examinarea microscopică la momente diferite a arătat că s-au format vacuole gigantice după 20 de ore de expunere la 5-iodoindol (0,1 mM). Vacuolele microscopice au fost observate după 8 ore de tratament, iar numărul lor a crescut după 12 ore. Au fost observate mai multe vacuole mari după 14 ore. Mai multe vacuole topite au fost clar vizibile după 12-16 ore de tratament, ceea ce indică faptul că fuziunea vacuolelor este baza mecanismului de moarte metanogenă. După 20 de ore, s-au găsit mai multe vacuole gigantice în întregul vierme. Aceste observații reprezintă primul raport de metuoză la C. elegans.
La viermii tratați cu 5-iodoindol, s-au observat, de asemenea, agregarea și ruptura vacuolelor (Fig. 5), așa cum se evidențiază prin îndoirea viermilor și eliberarea vacuolelor în mediu. De asemenea, s-a observat întreruperea vacuolei în membrana cojii de ou, care este în mod normal păstrată intactă de L2 în timpul eclozării (Fig. S2 suplimentară). Aceste observații susțin implicarea acumulării de lichid și a insuficienței osmoreglatoare, precum și a leziunii celulare reversibile (RCI), în procesul de formare și supurație a vacuolelor (Fig. 5).
Ipotizând rolul iodului în formarea vacuolei observate, am investigat activitatea nematicidă a iodurii de sodiu (NaI) și a iodurii de potasiu (KI). Cu toate acestea, la concentrații (0,1, 0,5 sau 1 mM), acestea nu au afectat nici supraviețuirea nematodelor, nici formarea de vacuole (Fig. S5 suplimentară), deși 1 mM KI a avut un efect nematicid ușor. Pe de altă parte, 7-iodoindol (1 sau 2 mM), ca și 5-iodoindol, a indus mai multe vacuole și deformații structurale (Fig. S6 suplimentară). Cei doi iodoindoli au prezentat caracteristici fenotipice similare la nematozii de pin, în timp ce NaI și KI nu. Interesant este că indolul nu a indus formarea de vacuole în B. xylophilus la concentrațiile testate (datele nu sunt prezentate). Astfel, rezultatele au confirmat că complexul indol-iod este responsabil pentru vacuolizarea și metabolismul B. xylophilus.
Dintre indolii testați pentru activitatea nematicidă, 5-iodoindol a avut cel mai mare indice de alunecare de -5,89 kcal/mol, urmat de 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) și indol (-4,03) (Figura 6). Legătura puternică de hidrogen a 5-iodoindolului la leucina 218 stabilizează legarea acesteia, în timp ce toți ceilalți derivați de indol se leagă de serină 260 prin legături de hidrogen ale lanțului lateral. Printre alți iodoindoli modelați, 2-iodoindol are o valoare de legare de -5,248 kcal/mol, care se datorează legăturii sale principale de hidrogen cu leucina 218. Alte legături cunoscute includ 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) și kcal/mol. (Figura suplimentară S8). Majoritatea indolilor halogenați și a indolului însuși, cu excepția 5-iodoindolului și 2-iodoindolului, formează o legătură cu serina 260. Faptul că legăturile de hidrogen cu leucina 218 indică legarea eficientă a receptorului-ligand, așa cum s-a observat pentru ivermectină (Fig. suplimentare S7 și 2-iodoindoi), confirmă faptul că ivermectina, se leagă strâns de locul activ al receptorului GluCL prin leucina 218 (Fig. 6 și Fig. S8 suplimentară). Propunem că această legare este necesară pentru a menține structura porilor deschisi a complexului GluCL și că prin legarea strânsă de situsul activ al receptorului GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectină și ivermectină mențin canalul ionic deschis și permite absorbția lichidului.
Andocare moleculară a indolului și indolului halogenat la GluCL. Orientările de legare ale liganzilor (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol și (D) 5-iodoindol la locul activ al GluCL. Proteina este reprezentată de o panglică, iar legăturile de hidrogen ale coloanei vertebrale sunt prezentate sub formă de linii punctate galbene. (A′), (B′), (C′) și (D′) arată interacțiunile liganzilor corespunzători cu resturile de aminoacizi din jur, iar legăturile de hidrogen din lanțul lateral sunt indicate prin săgeți punctate roz.
Au fost efectuate experimente pentru a evalua efectul toxic al 5-iodoindolului asupra germinării semințelor de varză și ridichi. 5-iodoindol (0,05 sau 0,1 mM) sau avermectina (10 μg/mL) au avut un efect redus sau deloc asupra germinării inițiale și a apariției plantule (Figura 7). În plus, nu a fost găsită nicio diferență semnificativă între rata de germinare a martorilor netratate și a semințelor tratate cu 5-iodoindol sau avermectină. Efectul asupra alungirii rădăcinii pivotante și asupra numărului de rădăcini laterale formate a fost nesemnificativ, deși 1 mM (de 10 ori concentrația sa activă) de 5-iodoindol a întârziat ușor dezvoltarea rădăcinilor laterale. Aceste rezultate indică faptul că 5-iodoindolul este netoxic pentru celulele plantei și nu interferează cu procesele de dezvoltare a plantelor la concentrațiile studiate.
Efectul 5-iodoindolului asupra germinării semințelor. Germinarea, încolțirea și înrădăcinarea laterală a semințelor de B. oleracea și R. raphanistrum pe mediu de agar Murashige și Skoog cu sau fără avermectină sau 5-iodoindol. Germinarea a fost înregistrată după 3 zile de incubare la 22°C.
Acest studiu raportează mai multe cazuri de ucidere a nematozilor de către indoli. Foarte important, acesta este primul raport de metilare care induce iodoindol (un proces cauzat de acumularea de vacuole mici care se contopesc treptat în vacuole gigantice, ducând în cele din urmă la ruperea membranei și moartea) în acele de pin, iodoindol prezentând proprietăți nematicide semnificative similare cu cele ale avermectinei nematicide comerciale.
S-a raportat anterior că indolii exercită funcții de semnalizare multiple la procariote și eucariote, inclusiv inhibarea/formarea biofilmului, supraviețuirea bacteriilor și patogenitatea19,32,33,34. Recent, efectele terapeutice potențiale ale indolilor halogenați, alcaloizilor indolici și derivaților semisintetici de indol au atras un interes extins de cercetare35,36,37. De exemplu, s-a demonstrat că indolii halogenați ucid celulele persistente de Escherichia coli și Staphylococcus aureus37. În plus, este de interes științific să se studieze eficacitatea indolilor halogenați împotriva altor specii, genuri și regate, iar acest studiu este un pas către atingerea acestui obiectiv.
Aici, propunem un mecanism pentru letalitatea indusă de 5-iodoindol în C. elegans, bazat pe lezarea celulară reversibilă (RCI) și metilare (Figurile 4C și 5). Modificările edematoase precum umflarea și degenerarea vacuolară sunt indicatori ai RCI și metilare, manifestate ca vacuole gigantice în citoplasmă48,49. RCI interferează cu producția de energie prin reducerea producției de ATP, provocând defecțiunea pompei ATPazei sau perturbând membranele celulare și provocând un aflux rapid de Na+, Ca2+ și apă50,51,52. Vacuolele intracitoplasmatice apar în celulele animale ca urmare a acumulării de lichid în citoplasmă din cauza influxului de Ca2+ și apă53. Interesant este că acest mecanism de deteriorare celulară este reversibil dacă deteriorarea este temporară și celulele încep să producă ATP pentru o anumită perioadă de timp, dar dacă deteriorarea persistă sau se agravează, celulele mor.54 Observațiile noastre arată că nematozii tratați cu 5-iodoindol nu sunt capabili să restabilească biosinteza normală după expunerea la condiții de stres.
Fenotipul de metilare indus de 5-iodoindol în B. xylophilus se poate datora prezenței iodului și distribuției sale moleculare, deoarece 7-iodoindol a avut un efect inhibitor mai puțin asupra B. xylophilus decât 5-iodoindol (Tabelul 1 și Figura suplimentară S6). Aceste rezultate sunt parțial în concordanță cu studiile lui Maltese și colab. (2014), care au raportat că translocarea fragmentului de azot piridil în indol din para- în poziția meta a abolit vacuolizarea, inhibarea creșterii și citotoxicitatea în celulele U251, sugerând că interacțiunea moleculei cu un site activ specific din proteină este critică27,44,45. Interacțiunile dintre indolii indol sau halogenați și receptorii GluCL observați în acest studiu susțin, de asemenea, această noțiune, deoarece s-a constatat că 5- și 2-iodoindol se leagă la receptorii GluCL mai puternic decât ceilalți indoli examinați (Figura 6 și Figura suplimentară S8). S-a descoperit că iodul din a doua sau a cincea poziție a indolului se leagă de leucina 218 a receptorului GluCL prin legături de hidrogen ale coloanei vertebrale, în timp ce alți indoli halogenați și indolul însuși formează legături slabe de hidrogen în lanțul lateral cu serina 260 (Figura 6). Prin urmare, speculăm că localizarea halogenului joacă un rol important în inducerea degenerării vacuolare, în timp ce legarea strânsă a 5-iodoindolului menține canalul ionic deschis, permițând astfel afluxul rapid de fluid și ruperea vacuolului. Cu toate acestea, mecanismul detaliat de acțiune al 5-iodoindolului rămâne de determinat.
Înainte de aplicarea practică a 5-iodoindolului, trebuie analizat efectul său toxic asupra plantelor. Experimentele noastre de germinare a semințelor au arătat că 5-iodoindolul nu a avut niciun efect negativ asupra germinării semințelor sau asupra proceselor de dezvoltare ulterioare la concentrațiile studiate (Figura 7). Astfel, acest studiu oferă o bază pentru utilizarea 5-iodoindolului în mediul ecologic pentru a controla nocivitatea nematozilor de pin pentru pini.
Rapoartele anterioare au demonstrat că terapia pe bază de indol reprezintă o abordare potențială pentru a aborda problema rezistenței la antibiotice și a progresiei cancerului55. În plus, indolii posedă activități antibacteriene, anticancerigene, antioxidante, antiinflamatorii, antidiabetice, antivirale, antiproliferative și antituberculoase și pot servi ca bază promițătoare pentru dezvoltarea medicamentelor56,57. Acest studiu sugerează pentru prima dată utilizarea potențială a iodului ca agent antiparazitar și antihelmintic.
Avermectina a fost descoperită în urmă cu trei decenii și a câștigat Premiul Nobel în 2015, iar utilizarea sa ca antihelmintic este încă în desfășurare activă. Cu toate acestea, datorită dezvoltării rapide a rezistenței la avermectine la nematode și insecte dăunătoare, este necesară o strategie alternativă, ieftină și ecologică pentru a controla infecția PWN la pini. Acest studiu raportează, de asemenea, mecanismul prin care 5-iodoindol ucide nematozii de pin și că 5-iodoindol are toxicitate scăzută pentru celulele vegetale, ceea ce deschide perspective bune pentru aplicarea sa comercială viitoare.
Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică al Universității Yeungnam, Gyeongsan, Coreea, iar metodele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului de etică al Universității Yeungnam.
Experimentele de incubare a ouălor au fost efectuate folosind proceduri stabilite43. Pentru a evalua ratele de ecloziune (HR), nematodele adulte de o zi (aproximativ 100 de femele și 100 de masculi) au fost transferate în vase Petri care conțineau ciuperca și lăsate să crească timp de 24 de ore. Ouăle au fost apoi izolate și tratate cu 5-iodoindol (0,05 mM și 0,1 mM) sau avermectină (10 μg/ml) ca o suspensie în apă distilată sterilă. Aceste suspensii (500 μl; aproximativ 100 de ouă) au fost transferate în godeurile unei plăci de cultură de țesut cu 24 de godeuri și incubate la 22 ° C. Numărările L2 au fost făcute după 24 de ore de incubație, dar au fost considerate moarte dacă celulele nu s-au mișcat atunci când au fost stimulate cu un fir fin de platină. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare cu șase repetări. Datele din ambele experimente au fost combinate și prezentate. Procentul de HR se calculează după cum urmează:
Mortalitatea larvelor a fost evaluată folosind proceduri dezvoltate anterior. Ouăle de nematozi au fost colectate și embrionii au fost sincronizați prin eclozare în apă distilată sterilă pentru a genera larve în stadiul L2. Larvele sincronizate (aproximativ 500 de nematode) au fost tratate cu 5-iodoindol (0,05 mM și 0,1 mM) sau avermectină (10 μg/ml) și crescute pe plăci B. cinerea Petri. După 48 de ore de incubare la 22 °C, nematozii au fost colectați în apă distilată sterilă și examinați pentru prezența stadiilor L2, L3 și L4. Prezența stadiilor L3 și L4 a indicat transformarea larvelor, în timp ce prezența stadiului L2 a indicat nicio transformare. Imaginile au fost achiziționate folosind sistemul iRiS™ Digital Cell Imaging System. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare cu șase repetări. Datele din ambele experimente au fost combinate și prezentate.
Toxicitatea 5-iodoindolului și avermectinei pentru semințe a fost evaluată folosind teste de germinare pe plăci de agar Murashige și Skoog.62 Semințele de B. oleracea și R. raphanistrum au fost mai întâi înmuiate în apă distilată sterilă timp de o zi, spălate cu 1 ml 100% etanol 100%, sterilizat cu 1 ml de sodiu din comerț, sterilizat 53% hipoclorit) timp de 15 minute și spălat de cinci ori cu 1 ml apă sterilă. Semințele sterilizate au fost apoi presate pe plăci de agar de germinare care conțineau 0,86 g/l (0,2X) mediu Murashige și Skoog și 0,7% agar bacteriologic cu sau fără 5-iodoindol sau avermectină. Plăcile au fost apoi incubate la 22 °C și imaginile au fost luate după 3 zile de incubare. Acest experiment a fost realizat în două etape, fiecare dintre ele având șase repetări.
Ora postării: 26-feb-2025