Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru rezultate optime, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stil sau JavaScript.
Descoperirea și utilizarea benefică a produselor naturale poate ajuta la îmbunătățirea vieții umane.Substanțele chimice care inhibă creșterea plantelor sunt utilizate pe scară largă ca erbicide pentru combaterea buruienilor.Datorită necesității de a utiliza diferite tipuri de erbicide, este nevoie de a identifica compuși cu noi mecanisme de acțiune.În acest studiu, am descoperit un nou compus N-alcoxipirol, cumamonamida, de la Streptomyces werraensis MK493-CF1 și am stabilit procesul de sinteză complet.Prin teste de activitate biologică, am descoperit că acidul urs-monoamic este un intermediar sintetic al urs-monoamidei și un potențialinhibitor de creștere a plantelor.În plus, am dezvoltat diverși derivați ai acidului urbenonic, inclusiv derivatul urbeniloxi (UDA), care are activitate erbicidă ridicată fără a afecta negativ creșterea celulelor HeLa.De asemenea, am descoperit că derivații de acid urmotonic perturbă microtubulii plantelor;în plus, KAND afectează filamentele de actină și induce moartea celulară;Aceste efecte cu mai multe fațete diferă de cele ale inhibitorilor de microtubuli cunoscuți și sugerează un nou mecanism de acțiune pentru acidul ursonic, care reprezintă un avantaj important în dezvoltarea de noi erbicide.
Descoperirea și aplicarea practică a produselor naturale benefice și a derivaților acestora este un mijloc de îmbunătățire a calității vieții umane.Metaboliții secundari produși de microorganisme, plante și insecte au condus la progrese majore în medicină și agricultură.Multe antibiotice și medicamente anti-leucemie au fost dezvoltate din produse naturale.În plus, diverse tipuri depesticide, fungicidele și erbicidele sunt extrase din aceste produse naturale pentru utilizare în agricultură.În special, erbicidele pentru combaterea buruienilor sunt instrumente importante pentru creșterea randamentului culturilor în agricultura modernă și diferite tipuri de compuși sunt deja utilizați comercial.Mai multe procese celulare din plante, cum ar fi fotosinteza, metabolismul aminoacizilor, sinteza peretelui celular, reglarea mitozei, semnalizarea fitohormonilor sau sinteza proteinelor, sunt considerate ținte tipice ale erbicidelor.Compușii care inhibă funcția microtubulilor sunt o clasă comună de erbicide care afectează creșterea plantelor, afectând reglarea mitotică2.
Microtubulii sunt componente ale citoscheletului și sunt larg conservați în celulele eucariote.Heterodimerul tubulinic este format din α-tubulină și β-tubulină care formează protofilamente liniare de microtubuli, cu 13 protofilamente formând o structură cilindrică.Microtubulii joacă roluri multiple în celulele vegetale, inclusiv determinarea formei celulei, diviziunea celulară și transportul intracelular3,4.Celulele vegetale conțin microtubuli sub membrana plasmatică interfazică și se crede că acești așa-numiți microtubuli corticali controlează organizarea microfibrilelor de celuloză prin reglarea complecșilor de celuloză sintetază4,5.Microtubuli corticali ai celulelor epidermice ale rădăcinii, prezenți în zona de alungire rapidă a vârfului rădăcinii, sunt localizați lateral, iar microfibrele celulozice urmează acești microtubuli și limitează direcția de expansiune celulară, promovând astfel alungirea celulelor anizotrope.Prin urmare, funcția microtubulilor este strâns legată de morfologia plantelor.Substituțiile de aminoacizi în genele care codifică tubulina provoacă deformarea matricelor de microtubuli corticali și creșterea pe partea stângă sau dreaptă în Arabidopsis 6,7.În mod similar, mutațiile proteinelor asociate microtubulilor care reglează dinamica microtubulilor pot duce, de asemenea, la creșterea distorsionată a rădăcinilor8,9,10,11,12,13.În plus, tratamentul cu erbicide care perturbă microtubuli, cum ar fi disopiramida, cunoscută și sub denumirea de pretilaclor, provoacă și creșterea rădăcinilor oblice pe partea stângă14.Aceste date indică faptul că reglarea precisă a funcției microtubulilor este critică pentru determinarea direcției de creștere a plantelor.
Au fost descoperite diferite tipuri de inhibitori ai microtubulilor, iar aceste medicamente au adus contribuții semnificative la cercetarea citoscheletică, precum și la agricultură și medicină2.În special, orizalina, compușii dinitroanilinei, disopiramida, compușii înrudiți cu benzamidă și analogii lor pot inhiba funcția microtubulilor și, prin urmare, pot inhiba creșterea plantelor.Prin urmare, sunt utilizate pe scară largă ca erbicide.Cu toate acestea, deoarece microtubulii sunt o componentă importantă a celulelor vegetale și animale, majoritatea inhibitorilor de microtubuli sunt citotoxici pentru ambele tipuri de celule.Prin urmare, în ciuda utilității lor recunoscute ca erbicide, un număr limitat de agenți antimicrotubuli sunt utilizați în scopuri practice.
Streptomyces este un gen din familia Streptomyces, care include bacterii aerobe, gram-pozitive, filamentoase și este larg cunoscut pentru capacitatea sa de a produce o gamă largă de metaboliți secundari.Prin urmare, este considerată una dintre cele mai importante surse de noi produse naturale active biologic.În studiul actual, am descoperit un nou compus numit cumamonamidă, care a fost izolat din Streptomyces werraensis MK493-CF1 și S. werraensis ISP 5486. Utilizând analiza spectrală și analiza spectrală completă, structura cumamonamidei a fost caracterizată și scheletul său unic de N-alcoxipirol. a fost determinat.sinteză.Sa constatat că acidul ursmonic, un intermediar sintetic al ursmonoamidei și al derivaților săi, inhibă creșterea și germinarea popularei plante model Arabidopsis thaliana.Într-un studiu de relație structură-activitate, am descoperit că un compus cu C9 modificat în acid ursonic, numit derivat noniloxi al acidului ursonic (KAND), îmbunătățește semnificativ efectul inhibitor asupra creșterii și germinării.În special, inhibitorul de creștere a plantelor recent descoperit a afectat și creșterea tutunului și a hepaticului și nu a fost citotoxic pentru bacterii sau celulele HeLa.Mai mult, unii derivați de acid urmotonic induc un fenotip de rădăcină distorsionat, ceea ce implică faptul că acești derivați afectează direct sau indirect microtubulii.În concordanță cu această idee, observațiile noastre ale microtubulilor marcați fie imunohistochimic, fie cu proteine fluorescente indică faptul că tratamentul KAND depolimerizează microtubulii.În plus, tratamentul cu derivați de acid kumamotonic a perturbat microfilamentele de actină.Astfel, am descoperit un nou inhibitor de creștere a plantelor al cărui mecanism unic de acțiune implică distrugerea citoscheletului.
Tulpina MK493-CF1 a fost izolată din sol în Shinagawa-ku, Tokyo.Tulpina MK493-CF1 a format miceliu stromal bine ramificat.A fost determinată secvența parțială a genei ARN ribozomal 16S (1422 pb).Această tulpină este foarte asemănătoare cu S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tulpină tipică, 99,93%).Pe baza acestui rezultat, s-a determinat că această tulpină era strâns legată de tulpina tip de S. werraensis.Prin urmare, am numit provizoriu această tulpină S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T produce, de asemenea, aceiași compuși bioactivi.Deoarece au existat puține cercetări timpurii pentru obținerea de produse naturale din acest microorganism, au fost efectuate cercetări chimice suplimentare.După cultivarea S. werraensis MK493-CF1 pe mediu de orz prin fermentare în stare solidă la 30°C timp de 14 zile, mediul a fost extras cu 50% EtOH.60 ml de probă au fost uscate pentru a obține 59,5 mg de extract brut.Extractul brut a fost supus HPLC în fază inversă pentru a da N-metoxi-1 H-pirol-2-carboxamidă (1, denumit cumamonamidă, 36,0 mg).Cantitatea totală de 1 este de aproximativ 60% din extractul brut.Prin urmare, am decis să studiem în detaliu proprietățile kumamotoamidei 1.
Coumamonamida 1 este o pulbere amorfă albă și spectrometria de masă de înaltă rezoluție (HRESIMS) confirmă C6H8N2O2 (Fig. 1).Fragmentul de pirol C2-substituit al acestui compus este caracterizat prin 5H 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5, 5H în spectrul 1H RMN: 4,5 Hz , H-5) și 5H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), iar spectrul 13C RMN arată prezența a patru atomi de carbon sp2.Prezența unei grupări amidice la poziția C2 a fost evaluată prin corelarea HMBC de la protonul C-3 la carbonil amidă la 5C 161,1.În plus, vârfurile 1H și 13C RMN la 5H 4,10 (3H, S) și 5C 68,3 indică prezența grupărilor N-metoxi în moleculă.Deși poziția corectă a grupului metoxi nu fusese încă determinată utilizând analize spectroscopice, cum ar fi spectroscopia diferențelor îmbunătățite și abrevierea nucleară Overhauser (NOEDF), N-metoxi-1H-pirol-2-carboxamida a devenit primul compus candidat.
Pentru a determina structura corectă a lui 1, a fost efectuată o sinteză totală (Fig. 2a).Tratamentul 2-aminopiridinei 2 disponibile comercial cu m-CPBA a dus la N-oxidul 3 corespunzător cu randament cantitativ.După 2-aminoazidarea lui 2, reacția de ciclocondensare descrisă de Abramovici a fost efectuată în benzen la 90°C pentru a obține 1-hidroxi-1H-pirol-2-carbonitril dorit 5 în grame.Viteza 60% (două trepte).15,16.Metilarea și hidroliza lui 4 au dat apoi acid 1-metoxi-1H-pirol-2-carboxilic (numit „acid cumotonic”, 6) cu randament bun (70%, în două etape).În cele din urmă, amidarea prin intermediarul clorură acidă 6 folosind amoniac apos a dat amida Kumamoto 1 cu un randament de 98%.Toate datele spectrale ale 1 sintetizat au fost similare cu 1 izolat, astfel încât structura lui 1 a fost determinată;
Sinteza și analiza generală a activității biologice a urbenamidei și acidului urbenic.(a) Sinteza totală a amidei Kumamoto.(b) Răsadurile de Arabidopsis Columbia (Col) de tip sălbatic de șapte zile au fost cultivate pe plăci Murashige și Skoog (MS) care conțineau cumamonamidă 6 sau cumamonamidă 1 la concentrațiile indicate.Bara de scară = 1 cm.
În primul rând, am evaluat activitățile biologice ale urbenamidei și ale intermediarilor săi pentru capacitatea lor de a modula creșterea plantelor.Am adăugat diferite concentrații de ursmonamidă 1 sau acid ursmonic 6 în mediul MS agar și au cultivat răsaduri de Arabidopsis thaliana pe acest mediu.Aceste teste au arătat că concentrațiile mari (500 μM) de 6 au inhibat creșterea rădăcinilor (Fig. 2b).Apoi, am generat diverse derivate prin înlocuirea poziției N1 a lui 6 și am efectuat studii de relație structură-activitate asupra acestora (procesul de sinteză analogică este descris în Informațiile de sprijin (SI)).Răsadurile de Arabidopsis au fost cultivate pe un mediu care conține derivați de acid ursonic 50 μM și s-a măsurat lungimea rădăcinii.asa cum se vede in poza.După cum se arată în figurile 3a, b și S1, acizii cumamo au lungimi diferite de lanțuri alcoxi liniare (9, 10, 11, 12 și 13) sau lanțuri alcoxi mari (15, 16 și 17) în poziția N1.Derivații au prezentat o inhibare semnificativă a creșterii rădăcinilor.În plus, am constatat că aplicarea a 200 μM 10, 11 sau 17 a inhibat germinația (Figurile 3c și S2).
Studiul relației structură-activitate a amidei Kumamoto și a compușilor înrudiți.(a) Structura și schema de sinteză a analogilor.(b) Cuantificarea lungimii rădăcinii răsadurilor de 7 zile cultivate pe mediu MS cu sau fără derivați de cumamonamidă 50 μM.Asteriscurile indică diferențe semnificative cu tratamentul simulat (testul t, p< 0,05).n>18. Datele sunt prezentate ca medie ± SD.nt înseamnă „netestat” deoarece mai mult de 50% dintre semințe nu au germinat.(c) Cuantificarea ratei de germinare a semințelor tratate incubate timp de 7 zile în mediu MS cu sau fără 200 μM cumamonamidă și compuși înrudiți.Asteriscurile indică diferențe semnificative cu tratamentul simulat (testul chi-pătrat).n=96.
Interesant este că adăugarea de lanțuri laterale alchil mai lungi decât C9 a redus activitatea inhibitoare, sugerând că compușii înrudiți cu acidul kumamotoic necesită lanțuri laterale de o anumită dimensiune pentru a-și prezenta activitatea biologică.
Deoarece analiza relației structură-activitate a arătat că C9 a fost modificat în acid ursonic și derivatul noniloxi al acidului ursonic (denumit în continuare KAND 11) a fost cel mai eficient inhibitor de creștere a plantelor, am efectuat o caracterizare mai detaliată a KAND 11. Tratamentul Arabidopsis cu 50 μM KAND 11 a prevenit aproape complet germinația, în timp ce concentrațiile mai mici (40, 30, 20 sau 10 μM) de KAND 11 au inhibat creșterea rădăcinilor într-o manieră dependentă de doză (Fig. 4a, b).Pentru a testa dacă KAND 11 afectează viabilitatea meristemului rădăcină, am examinat meristemele rădăcinilor colorate cu iodură de propidiu (PI) și am măsurat dimensiunea zonei meristemului.Dimensiunea meristemului răsadurilor cultivate pe un mediu care conține 25 μM KAND-11 a fost de 151,1 ± 32,5 μm, în timp ce dimensiunea meristemului răsadurilor crescute pe un mediu de control care conține DMSO a fost de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , ceea ce indică faptul că KAND-11 restabilește activitatea celulară.răspândirea.Meristemul rădăcină.În concordanță cu aceasta, tratamentul KAND 11 a redus cantitatea de semnal al markerului de diviziune celulară CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS în meristemul rădăcină (Fig. 4e) 17.Aceste rezultate indică faptul că KAND 11 inhibă creșterea rădăcinilor prin reducerea activității de proliferare celulară.
Analiza efectului inhibitor al derivaților de acid urbenonic (derivați urbeniloxi) asupra creșterii.(a) Răsaduri de Col sălbatice de 7 zile crescute pe plăci MS cu concentrațiile indicate de KAND 11. Bară de scară = 1 cm.(b) Cuantificarea lungimii rădăcinii.Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05).n>16. Datele sunt prezentate ca medie ± SD.(c) Microscopia confocală a rădăcinilor Col sălbatice colorate cu iodură de propidiu crescute pe plăci MS cu sau fără 25 μM KAND 11. Parantezele albe indică meristemul rădăcinii.Bară de scară = 100 µm.(d) Cuantificarea mărimii meristemului radicular (n = 10 până la 11).Diferențele statistice au fost determinate folosind testul t (p< 0,05).Barele reprezintă dimensiunea medie a meristemului.(e) Microscopie cu contrast de interferență diferențială (DIC) a unui meristem rădăcină care conține constructul CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS colorat și colorat pe răsaduri de 5 zile crescute pe plăci MS cu sau fără test KAND de 25 pM.
Fitotoxicitatea KAND 11 a fost testată în continuare utilizând o altă plantă dicotiledonată, tutun (Nicotiana tabacum) și un organism model de plante terestre majore, hepatica (Marchantia polymorpha).Ca și în cazul Arabidopsis, răsadurile de tutun SR-1 cultivate pe mediu care conține 25 μM KAND 11 au produs rădăcini mai scurte (Fig. 5a).În plus, 40 din 48 de semințe au germinat pe plăci care conțineau 200 μM KAND 11, în timp ce toate cele 48 de semințe au germinat pe medii tratate simulat, ceea ce indică faptul că concentrațiile mai mari de KAND au fost semnificative (p.< 0,05;testul chi -pătrat) a inhibat germinarea tutunului.(Fig. 5b).În plus, concentrația de KAND 11 care a inhibat creșterea bacteriană în hepatic a fost similară cu concentrația efectivă din Arabidopsis (Fig. 5c).Aceste rezultate indică faptul că KAND 11 poate inhiba creșterea unei varietăți de plante.Am investigat apoi posibila citotoxicitate a compușilor înrudiți cu monoamidă de urs în alte organisme, și anume celulele HeLa umane și tulpina DH5α de Escherichia coli, ca reprezentanți ai celulelor superioare animale și, respectiv, bacteriene.Într-o serie de teste de proliferare celulară, am observat că cumamonamida 1, acidul cumamonamidic 6 și KAND 11 nu au afectat creșterea celulelor HeLa sau E. coli la concentrații de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibarea creșterii KAND 11 în organismele non-Arabidopsis.(a) Răsadurile de tutun SR-1 de tip sălbatic de două săptămâni au fost cultivate pe plăci MS poziționate vertical care conțineau 25 μM KAND 11. (b) Răsadurile de tutun SR-1 de tip sălbatic de două săptămâni au fost cultivate pe poziționate orizontal Plăci MS care conțin 200 μM KAND 11. (c) Muguri de hepatic Tak-1 de tip sălbatic de două săptămâni cultivați pe plăci Gamborg B5 cu concentrațiile indicate de KAND 11. Săgețile roșii indică sporii care au încetat să crească în timpul incubației de două săptămâni perioadă.( d ) Testul de proliferare celulară a celulelor HeLa.Numărul de celule viabile a fost măsurat la intervale de timp fixe folosind un kit de numărare a celulelor 8 (Dojindo).Ca control, celulele HeLa au fost tratate cu 5 μg/ml actinomicină D (Act D), care inhibă transcripția ARN polimerazei și provoacă moartea celulelor.Analizele au fost efectuate în trei exemplare.(e) Test de proliferare a celulelor E. coli.Creșterea E. coli a fost analizată prin măsurarea OD600.Ca martor, celulele au fost tratate cu 50 μg/ml ampicilină (Amp), care inhibă sinteza peretelui celular bacterian.Analizele au fost efectuate în trei exemplare.
Pentru a descifra mecanismul de acțiune al citotoxicității cauzate de compușii înrudiți cu uramidă, am reanalizat derivații de acid urbenic cu efecte inhibitoare moderate.asa cum se vede in poza.După cum se arată în figurile 2b, 6a, răsaduri cultivate pe plăci de agar care conțin concentrații mari (200 μM) de acid urmotonic 6 au produs rădăcini mai scurte și curbate la stânga (θ = – 23,7 ± 6,1), în timp ce din răsadurile crescute pe mediul martor, răsadurile au produs rădăcini aproape drepte (θ = – 3,8 ± 7,1).Se știe că această creștere oblică caracteristică rezultă din disfuncția microtubulilor corticali14,18.În concordanță cu această descoperire, medicamentele de destabilizare a microtubulilor disopiramida și orizalina au indus o înclinare similară a rădăcinii în condițiile noastre de creștere (Figurile 2b, 6a).Totodată, am testat derivați de acid urmotonic și am selectat câțiva dintre aceștia care, la anumite concentrații, au indus creșterea rădăcinilor oblice.Compușii 8, 9 și 15 au schimbat direcția de creștere a rădăcinii la 75 μM, 50 μM și, respectiv, 40 μM, indicând faptul că acești compuși pot destabiliza în mod eficient microtubulii (Fig. 2b, 6a).Am testat, de asemenea, cel mai puternic derivat al acidului ursolic, KAND 11, la o concentrație mai mică (15 µM) și am constatat că aplicarea KAND 11 a inhibat creșterea rădăcinilor și că direcția de creștere a rădăcinilor a fost neuniformă, deși acestea tindeau să se încline spre stânga ( Figura C3)..Deoarece concentrații mai mari de medicamente destabilizatoare de microtubuli inhibă uneori creșterea plantelor, mai degrabă decât să provoace înclinarea rădăcinii, ulterior am evaluat posibilitatea ca KAND 11 să afecteze microtubulii prin observarea microtubulilor corticali în celulele epidermice ale rădăcinii.Imunohistochimia folosind anticorpi anti-β-tubulină în celulele epidermice ale rădăcinilor răsadurilor tratate cu 25 μM KAND 11 a arătat dispariția aproape a tuturor microtubulilor corticali din celulele epidermice din zona de alungire (Fig. 6b).Aceste rezultate indică faptul că acidul kumamotonic și derivații săi acționează direct sau indirect asupra microtubulilor pentru a-i perturba și că acești compuși sunt inhibitori noi de microtubuli.
Acidul ursonic și derivații săi modifică microtubulii corticali la Arabidopsis thaliana.(a) Unghiul de înclinare a rădăcinii măsurat în prezența diverșilor derivați ai acidului urmotonic la concentrațiile indicate.Au fost analizate și efectele a doi compuși cunoscuți că inhibă microtubulii: disopiramida și orizalina.În insertul arată standardul utilizat pentru măsurarea unghiului de creștere a rădăcinii.Asteriscurile indică diferențe semnificative cu tratamentul simulat (testul t, p< 0,05).n>19. Bară de scară = 1 cm.(b) Microtubuli corticali în celulele epidermice din zona de alungire.Microtubulii din rădăcinile Arabidopsis Col de tip sălbatic cultivate pe plăci MS cu sau fără 25 μM KAND 11 au fost vizualizați prin colorare imunohistochimică folosind anticorpi primari β-tubulină și anticorpi secundari conjugați Alexa Fluor.Bară de scară = 10 µm.(c) Structura mitotică a microtubulilor din meristemul rădăcinii.Microtubulii au fost vizualizați folosind colorarea imunohistochimică.Structurile mitotice, inclusiv zonele de profază, fusurile și fragmoplastele, au fost numărate din imagini confocale.Săgețile indică structurile microtubulilor mitotice.Asteriscurile indică diferențe semnificative cu tratamentul simulat (testul t, p< 0,05).n>9. Bară de scară = 50 µm.
Deși Ursa are capacitatea de a perturba funcția microtubulilor, mecanismul său de acțiune este de așteptat să fie diferit de agenții tipici de depolimerizare a microtubulilor.De exemplu, concentrații mai mari de agenți de depolimerizare a microtubulilor, cum ar fi disopiramida și orizalina, induc expansiunea anizotropă a celulelor epidermice, în timp ce KAND 11 nu o face.În plus, aplicarea concomitentă a KAND 11 și a disopiramidei a dus la un răspuns combinat de creștere a rădăcinii indus de disopiramidă și a fost observată inhibarea creșterii indusă de KAND 11 (Fig. S4).Am analizat, de asemenea, răspunsul mutantului hipersensibil al disopiramidei 1-1 (phs1-1) la KAND 11. phs1-1 are o mutație punctuală a tubulin kinazei non-canonice și produce rădăcini mai scurte atunci când este tratată cu disopiramidă9,20.Răsadurile mutante phs1-1 cultivate pe mediu de agar care conținea KAND 11 au avut rădăcini mai scurte similare cu cele cultivate pe disopiramidă (fig. S5).
În plus, am observat structuri de microtubuli mitotice, cum ar fi zone de profază, fusuri și fragmoplaste, în meristemul rădăcină al răsadurilor tratate cu KAND 11. În concordanță cu observațiile pentru CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, o scădere semnificativă a s-a observat numărul de microtubuli mitotici (Fig. .6c).
Pentru a caracteriza citotoxicitatea KAND 11 la rezoluția subcelulară, am tratat celulele suspensiei de tutun BY-2 cu KAND 11 și am observat răspunsul acestora.Am adăugat mai întâi KAND 11 la celulele BY-2 care exprimă TagRFP-TUA6, care etichetează fluorescent microtubulii, pentru a evalua efectul KAND 11 asupra microtubulilor corticali.Densitatea microtubulilor corticali a fost evaluată utilizând analiza imaginii, care a cuantificat procentul de pixeli citoscheletici dintre pixelii citoplasmatici.Rezultatele testului au arătat că după tratamentul cu 50 μM sau 100 μM KAND 11 timp de 1 oră, densitatea a scăzut semnificativ la 0,94 ± 0,74% sau, respectiv, 0,23 ± 0,28%, în timp ce densitatea celulelor tratate cu DMSO s-a ridicat la ± 1061. % (Fig. 7a).Aceste rezultate sunt în concordanță cu observația din Arabidopsis că tratamentul cu KAND 11 induce depolimerizarea microtubulilor corticali (Fig. 6b).De asemenea, am examinat linia BY-2 cu filamente de actină marcate cu GFP-ABD după tratamentul cu aceeași concentrație de KAND 11 și am observat că tratamentul cu KAND 11 a perturbat filamentele de actină.Tratamentul cu 50 μM sau 100 μM KAND 11 timp de 1 oră a redus semnificativ densitatea filamentului de actină la 1,20 ± 0,62% sau, respectiv, 0,61 ± 0,26%, în timp ce densitatea în celulele tratate cu DMSO a fost de 1,69 ± 0,69% ± 0,26%.7b).Aceste rezultate contrastează cu efectele propizamidei, care nu afectează filamentele de actină, și ale latrunculinei B, un depolimerizator de actină care nu afectează microtubulii (SI Figura S6).În plus, tratamentul cu cumamonamidă 1, cumamonamidă acid 6 sau KAND 11 nu a afectat microtubulii din celulele HeLa (SI Figura S7).Astfel, se crede că mecanismul de acțiune al lui KAND 11 este diferit de cel al perturbatorilor cunoscuți ai citoscheletului.În plus, observația noastră microscopică a celulelor BY-2 tratate cu KAND 11 a dezvăluit debutul morții celulare în timpul tratamentului KAND 11 și a arătat că proporția de celule moarte colorate cu albastru Evans nu a crescut semnificativ după 30 de minute de tratament cu KAND 11, în timp ce după 90 de minute de tratament cu 50 μM sau 100 μM KAND, numărul de celule moarte a crescut la 43,7% sau, respectiv, 80,1% (Fig. 7c).Luate împreună, aceste date indică faptul că noul derivat al acidului ursolic KAND 11 este un inhibitor citoscheletic specific plantei cu un mecanism de acțiune necunoscut anterior.
KAND afectează microtubulii corticali, filamentele de actină și viabilitatea celulelor BY-2 de tutun.(a) Vizualizarea microtubulilor corticali în celulele BY-2 în prezența TagRFP-TUA6.Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie confocală.Densitatea microtubulilor corticali a fost calculată din micrografiile a 25 de celule independente.Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05).Bară de scară = 10 µm.( b ) Filamente de actină corticale în celulele BY-2 vizualizate în prezența GFP-ABD2.Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie confocală.Densitatea filamentelor de actină corticale a fost calculată din micrografiile a 25 de celule independente.Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05).Bară de scară = 10 µm.(c) Observarea celulelor BY-2 moarte prin colorarea cu albastru Evans.Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie în câmp luminos.n=3.Bară de scară = 100 µm.
Descoperirea și aplicarea de noi produse naturale a condus la progrese semnificative în diferite aspecte ale vieții umane, inclusiv în medicină și agricultură.Au fost efectuate cercetări istorice pentru a obține compuși utili din resursele naturale.În special, actinomicetele sunt cunoscute a fi utile ca antibiotice antiparazitare pentru nematode datorită capacității lor de a produce diferiți metaboliți secundari, cum ar fi avermectina, compusul principal al ivermectinei și bleomicinei și derivații săi, utilizați medicinal ca agent anticancer21,22.De asemenea, din actinomicete au fost descoperiți o varietate de compuși erbicizi, dintre care unii sunt deja utilizați comercial1,23.Prin urmare, analiza metaboliților actinomiceților pentru a izola produsele naturale cu activități biologice dorite este considerată o strategie eficientă.În acest studiu, am descoperit un nou compus, cumamonamidă, de la S. werraensis și l-am sintetizat cu succes.Acidul ursonic este un intermediar sintetic al urbenamidei și al derivaților săi.Poate provoca ondularea caracteristică a rădăcinilor, poate prezenta activitate erbicidă moderată până la puternică și poate afecta direct sau indirect microtubulii plantei.Cu toate acestea, mecanismul de acțiune al acidului urmotonic poate diferi de cel al inhibitorilor de microtubuli existenți, deoarece KAND 11 întrerupe și filamentele de actină și provoacă moartea celulelor, sugerând un mecanism de reglare prin care acidul urmotonic și derivații săi influențează o gamă largă de structuri citoscheletice..
Caracterizarea mai detaliată a acidului urbenonic va ajuta la înțelegerea mai bună a mecanismului de acțiune al acidului urbenonic.În special, următorul obiectiv este de a evalua capacitatea acidului ursonic de a se lega de microtubuli redusi pentru a determina dacă acidul ursonic și derivații săi acționează direct asupra microtubulilor și îi depolimerizează sau dacă acțiunea lor are ca rezultat destabilizarea microtubulilor.În plus, în cazul în care microtubulii nu sunt o țintă directă, identificarea locului de acțiune și a țintelor moleculare ale acidului ursonic pe celulele vegetale va ajuta la înțelegerea în continuare a proprietăților compușilor înrudiți și a posibilelor modalități de îmbunătățire a activității erbicide.Testul nostru de bioactivitate a relevat capacitatea citotoxică unică a acidului ursonic asupra creșterii plantelor precum Arabidopsis thaliana, tutun și hepatic, în timp ce nici celulele E. coli și nici HeLa nu au fost afectate.Toxicitatea redusă sau deloc pentru celulele animale este un avantaj al derivaților acidului ursonic dacă aceștia sunt dezvoltați ca erbicide pentru utilizare în câmpurile agricole deschise.Într-adevăr, deoarece microtubulii sunt structuri comune la eucariote, inhibarea lor selectivă în plante este o cerință cheie pentru erbicide.De exemplu, propizamida, un agent de depolimerizare a microtubulilor care se leagă direct de tubulină și inhibă polimerizarea, este folosită ca erbicid datorită toxicității sale scăzute pentru celulele animale24.Spre deosebire de disopiramide, benzamidele înrudite au specificități țintă diferite.Pe lângă microtubulii vegetali, RH-4032 sau benzoxamida inhibă și microtubulii celulelor animale sau, respectiv, oomicetele, iar zalilamida este utilizată ca fungicid datorită fitotoxicității sale scăzute25,26,27.Ursul recent descoperit și derivații săi prezintă citotoxicitate selectivă împotriva plantelor, dar este de remarcat faptul că modificările ulterioare le pot modifica specificitatea țintei, oferind potențial derivați suplimentari pentru controlul ciupercilor patogene sau al oomicetelor.
Proprietățile unice ale acidului urbenonic și ale derivaților săi sunt utile pentru dezvoltarea lor ca erbicide și utilizarea ca instrumente de cercetare.Importanța citoscheletului în controlul formei celulelor vegetale este recunoscută pe scară largă.Studiile anterioare au arătat că plantele au dezvoltat mecanisme complexe de organizare a microtubulilor corticali prin controlul dinamicii microtubulilor pentru a controla corect morfogeneza.Au fost identificate un număr mare de molecule responsabile de reglarea activității microtubulilor, iar cercetările conexe sunt încă în desfășurare3,4,28.Înțelegerea noastră actuală a dinamicii microtubulilor în celulele vegetale nu explică pe deplin mecanismele organizării microtubulilor corticali.De exemplu, deși atât disopiramida cât și orizalina pot depolimeriza microtubulii, disopiramida provoacă distorsiuni severe ale rădăcinii, în timp ce orizalina are un efect relativ ușor.Mai mult, mutațiile tubulinei, care stabilizează microtubulii, provoacă și dextrorotația rădăcinilor, în timp ce paclitaxelul, care stabilizează și dinamica microtubulilor, nu o face.Prin urmare, studierea și identificarea țintelor moleculare ale acidului ursolic ar trebui să ofere noi perspective asupra reglementării microtubulilor corticali ai plantelor.De asemenea, comparațiile viitoare ale substanțelor chimice care sunt eficiente în promovarea creșterii distorsionate, cum ar fi disopiramida, și substanțele chimice mai puțin eficiente, cum ar fi orizalina sau acidul kumamotor, vor oferi indicii despre modul în care are loc creșterea distorsionată.
Pe de altă parte, rearanjamentele citoscheletice legate de apărare reprezintă o altă posibilitate de a explica citotoxicitatea acidului ursonic.Infecția unui agent patogen sau introducerea unui elicitor în celulele plantei provoacă uneori distrugerea citoscheletului și moartea ulterioară a celulelor29.De exemplu, sa raportat că criptoxantina derivată din oomicete perturbă microtubulii și filamentele de actină înainte de moartea celulelor de tutun, similar cu ceea ce se întâmplă cu tratamentul KAND30,31.Asemănările dintre răspunsurile de apărare și răspunsurile celulare induse de acidul ursonic ne-au determinat să presupunem că acestea declanșează procese celulare comune, deși este evident un efect mai rapid și mai puternic al acidului ursonic decât criptoxantina.Cu toate acestea, studiile au arătat că ruperea filamentelor de actină promovează moartea celulară spontană, care nu este întotdeauna însoțită de distrugerea microtubulilor29.În plus, rămâne de văzut dacă fie agentul patogen, fie elicitorul cauzează creșterea distorsionată a rădăcinilor, așa cum fac derivații acidului ursonic.Astfel, cunoștințele moleculare care leagă răspunsurile de apărare și citoscheletul este o problemă atractivă care trebuie abordată.Prin exploatarea prezenței compușilor cu greutate moleculară mică legați de acidul ursonic, precum și a unei game de derivați cu potențe diferite, aceștia pot oferi oportunități de a viza mecanisme celulare necunoscute.
Luate împreună, descoperirea și aplicarea de noi compuși care modulează dinamica microtubulilor vor oferi metode puternice pentru a aborda mecanismele moleculare complexe care stau la baza determinării formei celulelor vegetale.În acest context, acidul urmotonic compus recent dezvoltat, care afectează microtubulii și filamentele de actină și induce moartea celulelor, poate oferi o oportunitate de a descifra legătura dintre controlul microtubulilor și aceste alte mecanisme.Astfel, analiza chimică și biologică folosind acid urbenonic ne va ajuta să înțelegem mecanismele de reglare moleculară care controlează citoscheletul plantei.
Se inoculează S. werraensis MK493-CF1 într-un balon Erlenmeyer de 500 mL care conține 110 mL de mediu de semințe constând din 2% (g/v) galactoză, 2% (g/v) pastă de esență, 1% (g/v) compoziție Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (g/v) extract de porumb (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), 0,2% (g/v) (NH4)2SO4 și 0,2% CaCO3 în apă deionizată.(pH 7,4 înainte de sterilizare).Culturile de semințe au fost incubate pe un agitator rotativ (180 rpm) la 27°C timp de 2 zile.Cultivarea producției prin fermentație în stare solidă.Cultura de semințe (7 ml) a fost transferată într-un balon K-1 de 500 ml care conține 40 g de mediu de producție constând din 15 g de orz presat (MUSO Co., Ltd., Japonia) și 25 g de apă deionizată (pH neajustat). înainte de sterilizare).).Fermentarea a fost efectuată la 30°C în întuneric timp de 14 zile.Materialul de fermentare a fost extras cu 40 ml/sticlă EtOH și centrifugat (1500 g, 4°C, 10 min).Supernatantul culturii (60 ml) a fost extras cu un amestec de 10% MeOH/EtOAc.Stratul organic a fost evaporat sub presiune redusă pentru a obține un reziduu (59,5 mg), care a fost supus HPLC cu gradient de eluare (0-10 minute: 90%) pe o coloană cu fază inversă (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × lungime 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN până la 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O /EtOH la 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) la un debit de 1,5 ml/min, cumamonamidă (1, 36,0 mg) a fost izolată ca o pulbere amorfă albă.
Kumamotoamidă (1);1H-RMN (500 MHz, CDCI3) 5 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).), 4,08 (s, 3H);13C-RMN (125 MHz, CDCI3) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valoare calculată: 141,0659, valoare măsurată: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1,537
Semințele Columbia (Col-0) au fost obținute de la Centrul de Resurse Biologice Arabidopsis (ABRC) cu permisiunea de utilizare în cercetare.Semințele Col-0 au fost înmulțite și menținute în condițiile noastre de laborator și utilizate ca plante Arabidopsis de tip sălbatic.Semințele de Arabidopsis au fost sterilizate la suprafață și cultivate în mediu Murashige și Skoog cu jumătate de rezistență, care conține 2% zaharoză (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (g/v) acid 2-(4-morfolino)etansulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) și agar 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, la 23 °C și lumină constantă.Semințele mutantului phs1-1 au fost furnizate de T. Hashimoto (Institutul Nara de Știință și Tehnologie).
Semințele tulpinii SR-1 au fost furnizate de T. Hashimoto (Institutul Nara de Știință și Tehnologie) și utilizate ca plante de tutun de tip sălbatic.Semințele de tutun au fost sterilizate la suprafață și înmuiate în apă sterilă timp de trei nopți pentru a promova germinarea, apoi plasate într-o soluție cu jumătate de tărie care conține 2% zaharoză, 0,05% (g/v) MES și 0,8% gumă gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.şi mediu Skoog) cu pH 5,7 şi incubat la 23°C sub lumină constantă.
Tulpina Tak-1 a fost furnizată de T. Kohchi (Universitatea Kyoto) și a fost utilizată ca unitate experimentală standard pentru studiul hepatic.Gemma a fost obținută din plante cultivate sterilizate și apoi placată pe mediu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) care conține 1% zaharoză și 0,3% gumă gellan și incubată la 23°C sub lumină continuă.
Celulele BY-2 de tutun (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) au fost furnizate de S. Hasezawa (Universitatea din Tokyo).Celulele BY-2 au fost diluate de 95 de ori în mediu Linsmeier și Skoog modificat și suplimentate săptămânal cu acid 2,4-diclorfenoxiacetic 32.Suspensia celulară a fost amestecată pe un agitator rotativ la 130 rpm la 27°C la întuneric.Spălați celulele cu de 10 ori volumul mediu proaspăt și resuspendați în același mediu.Liniile celulare transgenice BY-2 care exprimă stabil markerul de microtubuli TagRFP-TUA6 sau markerul de filament de actină GFP-ABD2 sub promotorul virusului mozaic de conopidă 35S au fost generate așa cum este descris33,34,35.Aceste linii celulare pot fi menținute și sincronizate folosind proceduri similare cu cele utilizate pentru linia celulară originală BY-2.
Celulele HeLa au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 1,2 U/ml penicilină și 1,2 μg/ml streptomicina într-un incubator la 37°C cu 5% CO2.
Toate experimentele descrise în acest manuscris au fost efectuate în conformitate cu reglementările și ghidurile japoneze de biosecuritate.
Compușii au fost dizolvați în dimetil sulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ca soluții stoc și diluați în mediu MS pentru Arabidopsis și tutun sau mediu Gamborg B5 pentru hepatic.Pentru testul de inhibare a creșterii rădăcinilor, mai mult de 10 semințe pe placă au fost semănate pe mediu de agar care conține compușii indicați sau DMSO.Semințele au fost incubate într-o cameră de creștere timp de 7 zile.S-au fotografiat răsadurile și s-a măsurat lungimea rădăcinilor.Pentru testul de germinare Arabidopsis, 48 de semințe pe placă au fost semănate pe mediu de agar care conține 200 μM compus sau DMSO.Semințele de Arabidopsis au fost crescute într-o cameră de creștere și numărul de puieți germinați a fost numărat la 7 zile după germinare (dag).Pentru testul de germinare a tutunului, 24 de semințe pe placă au fost semănate pe mediu de agar care conține 200 μM KAND sau DMSO.Semințele de tutun au fost cultivate într-o cameră de creștere și numărul de puieți germinați a fost numărat după 14 zile.Pentru testul de inhibare a creșterii hepatice, 9 embrioni de pe fiecare placă au fost placați pe mediu de agar care conține concentrațiile indicate de KAND sau DMSO și incubați într-o cameră de creștere timp de 14 zile.
Utilizați răsaduri colorate cu 5 mg/ml iodură de propidiu (PI) pentru a vizualiza organizarea meristemului rădăcină.Semnalele PI au fost observate prin microscopie cu fluorescență utilizând un microscop de scanare laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Colorarea histochimică a rădăcinilor cu β-glucuronidază (GUS) a fost efectuată conform protocolului descris de Malami și Benfey36.Răsadurile au fost fixate în acetonă 90% peste noapte, colorate cu 0,5 mg/ml acid 5-brom-4-clor-3-indolil-p-d-glucuronic în tampon GUS timp de 1 oră și plasate într-o soluție de cloraldehidă hidratată.(8 g hidrat de cloral, 2 ml apă și 1 ml glicerol) și observate prin microscopie de contrast cu interferență diferențială folosind un microscop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Unghiurile rădăcinilor au fost măsurate pe răsaduri de 7 zile crescute pe plăci așezate vertical.Măsurați unghiul rădăcinii față de direcția vectorului gravitațional așa cum este descris în pasul 6.
Aranjamentul microtubulilor corticali a fost observat așa cum este descris, cu modificări minore la protocol 37 .Anticorpul anti-β-tubulină (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) și IgG anti-șoarece conjugat Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) au fost utilizați ca anticorpi primari și secundari la diluții 1:1000 și 1:100, respectiv.Imaginile cu fluorescență au fost obținute folosind un microscop de scanare laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Obțineți imagini Z-stack și creați proiecții de intensitate maximă conform instrucțiunilor producătorului.
Testul de proliferare a celulelor HeLa a fost efectuat folosind Kitul de numărare a celulelor 8 (Dojindo) conform instrucțiunilor producătorului.
Creșterea E. coli DH5α a fost analizată prin măsurarea densității celulare în cultură folosind un spectrofotometru la 600 nm (OD600).
Organizarea citoscheletică în celulele transgenice BY-2 a fost observată utilizând un microscop cu fluorescență echipat cu un dispozitiv de scanare confocal CSU-X1 (Yokogawa) și o cameră sCMOS (Zyla, Andor Technology).Densitatea citoscheletică a fost evaluată prin analiză de imagine, care a cuantificat procentul de pixeli citoscheletici dintre pixelii citoplasmatici din imaginile confocale utilizând software-ul ImageJ așa cum este descris38,39.
Pentru a detecta moartea celulară în celulele BY-2, o alicotă din suspensia celulară a fost incubată cu 0,05% albastru Evans timp de 10 minute la temperatura camerei.Colorarea selectivă cu albastru Evans a celulelor moarte depinde de extrudarea colorantului din celulele viabile de către membrana plasmatică intactă40.Celulele colorate au fost observate folosind un microscop cu câmp luminos (BX53, Olympus).
Celulele HeLa au fost crescute în DMEM suplimentat cu 10% FBS într-un incubator umidificat la 37°C și 5% CO2.Celulele au fost tratate cu 100 μM KAND 11, acid kumamonamic 6, kumamonamidă 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) sau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) timp de 6 ore la 37°C.Celulele au fost fixate cu MetOH timp de 10 minute și apoi cu acetat timp de 5 minute la temperatura camerei.Celulele fixe au fost incubate cu anticorp primar p-tubulină (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluat în 0,5% BSA/PBS timp de 2 ore, spălate de 3 ori cu TBST și apoi incubate cu anticorp de capră Alexa Fluor.488 1 oră.– IgG de șoarece (Thermo Fisher Scientific: A11001) și 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluate în 0,5% BSA/PBS.După spălare cu TBST de trei ori, celulele colorate au fost observate pe un microscop inversat Nikon Eclipse Ti-E.Imaginile au fost capturate cu o cameră CCD Hamamatsu ORCA-R2 răcită utilizând software-ul MetaMorph (Molecular Devices).
Ora postării: 17-jun-2024