Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru cele mai bune rezultate, vă recomandăm să utilizați o versiune mai nouă a browserului dvs. (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, afișăm site-ul fără stilizare sau JavaScript.
Descoperirea și utilizarea benefică a produselor naturale pot contribui la îmbunătățirea vieții umane. Substanțele chimice inhibitoare ale creșterii plantelor sunt utilizate pe scară largă ca erbicide pentru controlul buruienilor. Datorită necesității de a utiliza diferite tipuri de erbicide, este nevoie de identificarea compușilor cu noi mecanisme de acțiune. În acest studiu, am descoperit un nou compus N-alcoxipirol, cumamonamida, de la Streptomyces werraensis MK493-CF1 și am stabilit procesul complet de sinteză. Prin teste de activitate biologică, am descoperit că acidul urs-monoamic este un intermediar sintetic al urs-monoamidei și un potențial...inhibitor de creștere a plantelorÎn plus, am dezvoltat diverși derivați ai acidului urbenonic, inclusiv derivatul urbeniloxi (UDA), care are o activitate erbicidă ridicată, fără a afecta negativ creșterea celulelor HeLa. De asemenea, am constatat că derivații acidului urmotonic perturbă microtubulii plantelor; în plus, KAND afectează filamentele de actină și induce moartea celulară; Aceste efecte multiple diferă de cele ale inhibitorilor de microtubuli cunoscuți și sugerează un nou mecanism de acțiune pentru acidul ursonic, ceea ce reprezintă un avantaj important în dezvoltarea de noi erbicide.
Descoperirea și aplicarea practică a produselor naturale benefice și a derivatelor acestora reprezintă un mijloc de îmbunătățire a calității vieții umane. Metaboliții secundari produși de microorganisme, plante și insecte au condus la progrese majore în medicină și agricultură. Multe antibiotice și medicamente antileucemice au fost dezvoltate din produse naturale. În plus, diverse tipuri depesticide, fungicidele și erbicidele sunt extrase din aceste produse naturale pentru a fi utilizate în agricultură. În special, erbicidele pentru combaterea buruienilor sunt instrumente importante pentru creșterea randamentelor culturilor în agricultura modernă, iar diverse tipuri de compuși sunt deja utilizați comercial. Mai multe procese celulare din plante, cum ar fi fotosinteza, metabolismul aminoacizilor, sinteza peretelui celular, reglarea mitozei, semnalizarea fitohormonilor sau sinteza proteinelor, sunt considerate ținte tipice ale erbicidelor. Compușii care inhibă funcția microtubulilor sunt o clasă comună de erbicide care afectează creșterea plantelor prin afectarea reglării mitotice2.
Microtubulii sunt componente ale citoscheletului și sunt conservați pe scară largă în celulele eucariote. Heterodimerul tubulinei este format din α-tubulină și β-tubulină, formând protofilamente liniare de microtubuli, cu 13 protofilamente care formează o structură cilindrică. Microtubulii joacă roluri multiple în celulele vegetale, inclusiv determinarea formei celulei, a diviziunii celulare și a transportului intracelular3,4. Celulele vegetale conțin microtubuli sub membrana plasmatică interfazică, iar acești așa-numiți microtubuli corticali se consideră că controlează organizarea microfibrilelor de celuloză prin reglarea complexelor de celuloză sintază4,5. Microtubulii corticali ai celulelor epidermice radiculare, prezenți în zona de alungire rapidă a vârfului rădăcinii, sunt situați lateral, iar microfibrele de celuloză urmează acești microtubuli și limitează direcția de expansiune celulară, promovând astfel alungirea anizotropă a celulelor. Prin urmare, funcția microtubulilor este strâns legată de morfologia plantelor. Substituțiile de aminoacizi din genele care codifică tubulina provoacă o asimetrie a rețelelor de microtubuli corticali și o creștere pe partea stângă sau dreaptă la *Arabidopsis* 6,7. În mod similar, mutațiile proteinelor asociate microtubulilor care reglează dinamica microtubulilor pot duce, de asemenea, la o creștere distorsionată a rădăcinilor 8,9,10,11,12,13. În plus, tratamentul cu erbicide care perturbă microtubulii, cum ar fi disopiramida, cunoscută și sub numele de pretilaclor, provoacă, de asemenea, o creștere oblică a rădăcinilor pe partea stângă 14. Aceste date indică faptul că reglarea precisă a funcției microtubulilor este esențială pentru determinarea direcției de creștere a plantelor.
Au fost descoperite diverse tipuri de inhibitori ai microtubulilor, iar aceste medicamente au adus contribuții semnificative cercetării citoscheletului, precum și agriculturii și medicinei2. În special, orizalina, compușii dinitroanilinici, disopiramida, compușii înrudiți cu benzamida și analogii acestora pot inhiba funcția microtubulilor și, prin urmare, pot inhiba creșterea plantelor. Prin urmare, aceștia sunt utilizați pe scară largă ca erbicide. Cu toate acestea, deoarece microtubulii sunt o componentă importantă a celulelor vegetale și animale, majoritatea inhibitorilor de microtubuli sunt citotoxici pentru ambele tipuri de celule. Prin urmare, în ciuda utilității lor recunoscute ca erbicide, un număr limitat de agenți antimicrotubuli sunt utilizați în scopuri practice.
Streptomyces este un gen din familia Streptomyces, care include bacterii aerobe, gram-pozitive, filamentoase și este cunoscut pe scară largă pentru capacitatea sa de a produce o gamă largă de metaboliți secundari. Prin urmare, este considerat una dintre cele mai importante surse de noi produse naturale biologic active. În studiul actual, am descoperit un nou compus numit cumamonamidă, care a fost izolat din Streptomyces werraensis MK493-CF1 și S. werraensis ISP 5486. Folosind analiza spectrală și analiza spectrală completă, a fost caracterizată structura cumamonamidei și a fost determinat scheletul său unic de N-alcoxipirol. sinteză. S-a constatat că acidul ursmonic, un intermediar sintetic al ursmonoamidei și derivaților acesteia, inhibă creșterea și germinarea popularei plante model Arabidopsis thaliana. Într-un studiu privind relația structură-activitate, am constatat că un compus cu C9 modificat în acid ursonic, numit derivat noniloxi al acidului ursonic (KAND), sporește semnificativ efectul inhibitor asupra creșterii și germinării. În mod notabil, inhibitorul de creștere a plantelor nou descoperit a afectat și creșterea tutunului și a hepaticei și nu a fost citotoxic pentru bacterii sau celulele HeLa. Mai mult, unii derivați ai acidului urmotonic induc un fenotip distorsionat al rădăcinii, ceea ce implică faptul că acești derivați afectează direct sau indirect microtubulii. În concordanță cu această idee, observațiile noastre asupra microtubulilor marcați fie imunohistochimic, fie cu proteine fluorescente indică faptul că tratamentul KAND depolimerizează microtubulii. În plus, tratamentul cu derivați ai acidului kumamotonic a perturbat microfilamentele de actină. Astfel, am descoperit un nou inhibitor de creștere a plantelor al cărui mecanism unic de acțiune implică distrugerea citoscheletului.
Tulpina MK493-CF1 a fost izolată din sol în Shinagawa-ku, Tokyo. Tulpina MK493-CF1 a format miceliu stromal bine ramificat. A fost determinată secvența parțială a genei ARN ribozomal 16S (1422 pb). Această tulpină este foarte similară cu S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: tulpină tipică, 99,93%). Pe baza acestui rezultat, s-a stabilit că această tulpină este strâns înrudită cu tulpina tip de S. werraensis. Prin urmare, am denumit provizoriu această tulpină S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T produce, de asemenea, aceiași compuși bioactivi. Deoarece au existat puține cercetări timpurii privind obținerea de produse naturale din acest microorganism, au fost efectuate cercetări chimice suplimentare. După cultivarea S. werraensis MK493-CF1 pe mediu de orz prin fermentație în stare solidă la 30°C timp de 14 zile, mediul a fost extras cu 50% EtOH. 60 ml de probă au fost uscați pentru a obține 59,5 mg de extract brut. Extractul brut a fost supus HPLC în fază inversă pentru a obține N-metoxi-1H-pirol-2-carboxamidă (1, denumită cumamonamidă, 36,0 mg). Cantitatea totală de 1 reprezintă aproximativ 60% din extractul brut. Prin urmare, am decis să studiem în detaliu proprietățile kumamotoamidei 1.
Coumamonamida 1 este o pulbere amorfă albă, iar spectrometria de masă de înaltă rezoluție (HRESIMS) confirmă prezența C6H8N2O2 (Fig. 1). Fragmentul de pirol substituit cu C2 al acestui compus este caracterizat prin δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH în spectrul RMN 1H: 4,5 Hz, H-5) și δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), iar spectrul RMN 13C arată prezența a patru atomi de carbon sp2. Prezența unei grupări amidice în poziția C2 a fost evaluată prin corelație HMBC de la protonul C-3 la carbonul carbonilic al amidei la δC 161,1. În plus, vârfurile RMN 1H și 13C la δH 4,10 (3H, S) și δC 68,3 indică prezența grupărilor N-metoxi în moleculă. Deși poziția corectă a grupării metoxi nu a fost încă determinată folosind analiza spectroscopică, cum ar fi spectroscopia diferențială îmbunătățită și abrevierea nucleară Overhauser (NOEDF), N-metoxi-1H-pirol-2-carboxamida a devenit primul compus candidat.
Pentru a determina structura corectă a compusului 1, s-a efectuat o sinteză totală (Fig. 2a). Tratarea 2-aminopiridinei 2 disponibile comercial cu m-CPBA a dus la obținerea N-oxidului 3 corespunzător, cu randament cantitativ. După 2-aminoazidarea compusului 2, reacția de ciclocondensare descrisă de Abramovich a fost efectuată în benzen la 90°C pentru a obține 1-hidroxi-1H-pirol-2-carbonitrilul 5 dorit, în grame. Viteză 60% (două etape). 15,16. Metilarea și hidroliza compusului 4 au dat apoi acid 1-metoxi-1H-pirol-2-carboxilic (denumit „acid cumotonic”, 6) cu randament bun (70%, două etape). În final, amidarea prin intermediul intermediarului clorură de acid 6 folosind amoniac apos a dat amida Kumamoto 1 cu randament de 98%. Toate datele spectrale ale compusului 1 sintetizat au fost similare cu cele ale compusului 1 izolat, astfel încât structura compusului 1 a fost determinată;
Sinteză generală și analiză a activității biologice a urbenamidei și acidului urbenic. (a) Sinteză totală a amidei Kumamoto. (b) Răsadurile de Arabidopsis Columbia (Col) de tip sălbatic, în vârstă de șapte zile, au fost cultivate pe plăci Murashige și Skoog (MS) conținând cumamonamidă 6 sau cumamonamidă 1 la concentrațiile indicate. Bara de scală = 1 cm.
Mai întâi, am evaluat activitățile biologice ale urbenamidei și ale intermediarilor acesteia pentru capacitatea lor de a modula creșterea plantelor. Am adăugat diferite concentrații de ursmonamidă 1 sau acid ursonic 6 în mediu MS agar și am cultivat răsaduri de Arabidopsis thaliana pe acest mediu. Aceste teste au arătat că concentrațiile mari (500 μM) de 6 au inhibat creșterea rădăcinilor (Fig. 2b). Apoi, am generat diverși derivați prin substituirea poziției N1 a compusului 6 și am efectuat studii privind relația structură-activitate pe aceștia (procesul de sinteză analogică este descris în Informațiile Suplimentare (SI)). Răsadurile de Arabidopsis au fost cultivate pe un mediu care conține 50 μM derivați de acid ursonic, iar lungimea rădăcinii a fost măsurată, așa cum se arată în imagine. După cum se arată în Figurile 3a, b și S1, acizii cumamo au lungimi diferite ale lanțurilor alcoxi liniare (9, 10, 11, 12 și 13) sau lanțuri alcoxi mari (15, 16 și 17) în poziția N1. Derivații au demonstrat o inhibare semnificativă a creșterii rădăcinilor. În plus, am constatat că aplicarea a 200 μM de 10, 11 sau 17 a inhibat germinarea (Fig. 3c și S2).
Studiul relației structură-activitate a amidei Kumamoto și a compușilor înrudiți. (a) Structura și schema de sinteză a analogilor. (b) Cuantificarea lungimii rădăcinii la răsaduri de 7 zile cultivate pe mediu MS cu sau fără derivați de cumamonamidă 50 μM. Asteriscurile indică diferențe semnificative față de tratamentul simulat (testul t, p< 0,05). n>18. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard. nt înseamnă „netestat” deoarece mai mult de 50% dintre semințe nu au germinat. (c) Cuantificarea ratei de germinare a semințelor tratate, incubate timp de 7 zile în mediu MS cu sau fără 200 μM cumamonamidă și compuși înrudiți. Asteriscurile indică diferențe semnificative față de tratamentul simulat (testul chi-pătrat). n=96.
Interesant este că adăugarea de lanțuri laterale alchilice mai lungi decât C9 a redus activitatea inhibitorie, sugerând că compușii înrudiți cu acidul kumamotoic necesită lanțuri laterale de o anumită dimensiune pentru a-și manifesta activitatea biologică.
Deoarece analiza relației structură-activitate a arătat că C9 a fost modificat în acid ursonic, iar derivatul noniloxi al acidului ursonic (denumit în continuare KAND 11) a fost cel mai eficient inhibitor de creștere a plantelor, am efectuat o caracterizare mai detaliată a KAND 11. Tratamentul Arabidopsis cu 50 μM KAND 11 a prevenit aproape complet germinarea, în timp ce concentrații mai mici (40, 30, 20 sau 10 μM) de KAND 11 au inhibat creșterea rădăcinilor într-un mod dependent de doză (Fig. 4a, b). Pentru a testa dacă KAND 11 afectează viabilitatea meristemului radicular, am examinat meristemele radiculare colorate cu iodură de propidiu (PI) și am măsurat dimensiunea ariei meristemului. Dimensiunea meristemului răsadurilor cultivate pe un mediu care conține 25 μM KAND-11 a fost de 151,1 ± 32,5 μm, în timp ce dimensiunea meristemului răsadurilor cultivate pe un mediu de control care conține DMSO a fost de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), ceea ce indică faptul că KAND-11 restabilește activitatea celulară. răspândire. Meristem radicular. În concordanță cu aceasta, tratamentul cu KAND 11 a redus cantitatea de semnal al markerului de diviziune celulară CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS în meristemul radicular (Fig. 4e) 17. Aceste rezultate indică faptul că KAND 11 inhibă creșterea rădăcinii prin reducerea activității de proliferare celulară.
Analiza efectului inhibitor al derivaților acidului urbenonic (derivați urbeniloxi) asupra creșterii. (a) Răsad de Col de tip sălbatic, în vârstă de 7 zile, cultivat pe plăci MS cu concentrațiile indicate de KAND 11. Scala = 1 cm. (b) Cuantificarea lungimii rădăcinii. Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. (c) Microscopie confocală a rădăcinilor de Col de tip sălbatic colorate cu iodură de propidiu, cultivate pe plăci MS cu sau fără KAND 11 25 μM. Parantezele albe indică meristemul radicular. Bara de scală = 100 µm. (d) Cuantificarea dimensiunii meristemului radicular (n = 10 până la 11). Diferențele statistice au fost determinate folosind testul t (p< 0,05). Barele reprezintă dimensiunea medie a meristemului. (e) Microscopie cu contrast interferențial diferențial (DIC) a unui meristem radicular care conține constructul CDKB2; 1pro: CDKB2; colorat cu 1-GUS și colorat pe răsaduri de 5 zile cultivate pe plăci MS cu sau fără test KAND de 25 µM.
Fitotoxicitatea KAND 11 a fost testată suplimentar utilizând o altă plantă dicotiledonată, tutunul (Nicotiana tabacum) și un organism model major pentru plante terestre, hepatica (Marchantia polymorpha). Ca și în cazul Arabidopsis, răsadurile de tutun SR-1 cultivate pe un mediu care conține 25 μM KAND 11 au produs rădăcini mai scurte (Fig. 5a). În plus, 40 din 48 de semințe au germinat pe plăci care conțin 200 μM KAND 11, în timp ce toate cele 48 de semințe au germinat pe medii tratate simulat, indicând faptul că concentrațiile mai mari de KAND au fost semnificative (p< 0,05; testul chi - pătrat) a inhibat germinarea tutunului. (Fig. 5b). În plus, concentrația de KAND 11 care a inhibat creșterea bacteriană la hepatică a fost similară cu concentrația eficientă la Arabidopsis (Fig. 5c). Aceste rezultate indică faptul că KAND 11 poate inhiba creșterea unei varietăți de plante. Apoi, am investigat posibila citotoxicitate a compușilor înrudiți cu monoamida de urs la alte organisme, și anume celulele HeLa umane și tulpina Escherichia coli DH5α, ca reprezentanți ai celulelor animale superioare și, respectiv, bacteriene. Într-o serie de teste de proliferare celulară, am observat că cumamonamida 1, acidul cumamonamidic 6 și KAND 11 nu au afectat creșterea celulelor HeLa sau E. coli la concentrații de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inhibarea creșterii KAND 11 în organismele non-Arabidopsis. (a) Răsadurile de tutun SR-1 de tip sălbatic, în vârstă de două săptămâni, au fost cultivate pe plăci MS poziționate vertical, conținând 25 μM KAND 11. (b) Răsadurile de tutun SR-1 de tip sălbatic, în vârstă de două săptămâni, au fost cultivate pe plăci MS poziționate orizontal, conținând 200 μM KAND 11. (c) Muguri de hepatică Tak-1 de tip sălbatic, în vârstă de două săptămâni, cultivați pe plăci Gamborg B5 cu concentrațiile indicate de KAND 11. Săgețile roșii indică sporii care au încetat să crească în perioada de incubație de două săptămâni. (d) Testul de proliferare celulară a celulelor HeLa. Numărul de celule viabile a fost măsurat la intervale fixe de timp utilizând un kit de numărare a celulelor 8 (Dojindo). Ca martor, celulele HeLa au fost tratate cu 5 μg/ml actinomicină D (Act D), care inhibă transcripția ARN polimerazei și provoacă moartea celulară. Analizele au fost efectuate în triplicat. (e) Testul de proliferare celulară E. coli. Creșterea E. coli a fost analizată prin măsurarea OD600. Ca martor, celulele au fost tratate cu ampicilină (Amp) 50 μg/ml, care inhibă sinteza peretelui celular bacterian. Analizele au fost efectuate în triplicat.
Pentru a descifra mecanismul de acțiune al citotoxicității cauzate de compușii înrudiți cu uramida, am reanalizat derivații acidului urbenic cu efecte inhibitorii moderate, așa cum se arată în imagine. După cum se arată în Figurile 2b, 6a, răsadurile cultivate pe plăci de agar conținând concentrații mari (200 μM) de acid urmotonic 6 au produs rădăcini mai scurte și curbate spre stânga (θ = – 23,7 ± 6,1), în timp ce dintre răsadurile cultivate pe mediul de control, răsadurile au produs rădăcini aproape drepte (θ = – 3,8 ± 7,1). Se știe că această creștere oblică caracteristică rezultă din disfuncția microtubulilor corticali14,18. În concordanță cu această constatare, medicamentele care destabilizau microtubulii, disopiramida și orizalina, au indus o înclinare similară a rădăcinilor în condițiile noastre de creștere (Fig. 2b, 6a). În același timp, am testat derivați ai acidului urmotonic și am selectat mai mulți dintre ei care, la anumite concentrații, au indus creșterea oblică a rădăcinilor. Compușii 8, 9 și 15 au modificat direcția de creștere a rădăcinilor la 75 μM, 50 μM și respectiv 40 μM, indicând faptul că acești compuși pot destabiliza eficient microtubulii (Fig. 2b, 6a). De asemenea, am testat cel mai puternic derivat al acidului ursolic, KAND 11, la o concentrație mai mică (15 µM) și am constatat că aplicarea de KAND 11 a inhibat creșterea rădăcinilor și că direcția de creștere a rădăcinilor a fost neuniformă, deși acestea au avut tendința de a se înclina spre stânga (Figura C3). Deoarece concentrațiile mai mari de medicamente care destabilizau microtubulii inhibă uneori creșterea plantelor, în loc să provoace înclinarea rădăcinilor, am evaluat ulterior posibilitatea ca KAND 11 să afecteze microtubulii prin observarea microtubulilor corticali din celulele epidermice radiculare. Imunohistochimia utilizând anticorpi anti-β-tubulină în celulele epidermice ale rădăcinilor de răsaduri tratate cu 25 μM KAND 11 a arătat dispariția aproape tuturor microtubulilor corticali din celulele epidermice din zona de alungire (Fig. 6b). Aceste rezultate indică faptul că acidul kumamotonic și derivații săi acționează direct sau indirect asupra microtubulilor pentru a-i perturba și că acești compuși sunt inhibitori noi ai microtubulilor.
Acidul ursonic și derivații săi modifică microtubulii corticali la *Arabidopsis thaliana*. (a) Unghiul de înclinare a rădăcinii măsurat în prezența diferiților derivați ai acidului urmotonic la concentrațiile indicate. De asemenea, au fost analizate efectele a doi compuși cunoscuți pentru inhibarea microtubulilor: disopiramida și orizalina. Inserția prezintă standardul utilizat pentru măsurarea unghiului de creștere a rădăcinii. Asteriscurile indică diferențe semnificative față de tratamentul simulat (testul t, p< 0,05). n>19. Bara de scală = 1 cm. (b) Microtubuli corticali în celulele epidermice din zona de elongație. Microtubulii din rădăcinile de Arabidopsis Col de tip sălbatic cultivate pe plăci MS cu sau fără KAND 11 25 μM au fost vizualizați prin colorare imunohistochimică folosind anticorpi primari β-tubulină și anticorpi secundari conjugați cu Alexa Fluor. Bara de scală = 10 µm. (c) Structura mitotică a microtubulilor din meristemul radicular. Microtubulii au fost vizualizați folosind colorare imunohistochimică. Structurile mitotice, inclusiv zonele profază, fusurile și fragmoplastele, au fost numărate din imaginile confocale. Săgețile indică structurile microtubulilor mitotici. Asteriscurile indică diferențe semnificative față de tratamentul simulat (testul t, p< 0,05). n>9. Bara de scală = 50 µm.
Deși Ursa are capacitatea de a perturba funcția microtubulilor, se așteaptă ca mecanismul său de acțiune să fie diferit de cel al agenților tipici de depolimerizare a microtubulilor. De exemplu, concentrații mai mari de agenți de depolimerizare a microtubulilor, cum ar fi disopiramida și orizalina, induc expansiunea anizotropă a celulelor epidermice, în timp ce KAND 11 nu o face. În plus, aplicarea concomitentă de KAND 11 și disopiramidă a dus la un răspuns combinat de creștere a rădăcinilor indus de disopiramidă și s-a observat inhibarea creșterii indusă de KAND 11 (Fig. S4). De asemenea, am analizat răspunsul mutantului hipersensibil disopiramidă 1-1 (phs1-1) la KAND 11. phs1-1 are o mutație punctuală non-canonică a tubulin kinazei și produce rădăcini mai scurte atunci când este tratat cu disopiramidă9,20. Răsadurile mutante phs1-1 cultivate pe mediu de agar care conține KAND 11 au avut rădăcini mai scurte, similare cu cele cultivate pe disopiramidă (fig. S5).
În plus, am observat structuri de microtubuli mitotici, cum ar fi zonele de profază, fusurile celulare și fragmoplastele, în meristemul radicular al răsadurilor tratate cu KAND 11. În concordanță cu observațiile pentru CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, s-a observat o scădere semnificativă a numărului de microtubuli mitotici (Fig. .6c).
Pentru a caracteriza citotoxicitatea KAND 11 la rezoluție subcelulară, am tratat celule în suspensie BY-2 din tutun cu KAND 11 și am observat răspunsul acestora. Mai întâi am adăugat KAND 11 la celulele BY-2 care exprimă TagRFP-TUA6, care marchează fluorescent microtubulii, pentru a evalua efectul KAND 11 asupra microtubulilor corticali. Densitatea microtubulilor corticali a fost evaluată utilizând analiza imaginilor, care a cuantificat procentul de pixeli citoscheletici printre pixelii citoplasmatici. Rezultatele testului au arătat că, după tratamentul cu 50 μM sau 100 μM KAND 11 timp de 1 oră, densitatea a scăzut semnificativ la 0,94 ± 0,74% sau, respectiv, 0,23 ± 0,28%, în timp ce densitatea celulelor tratate cu DMSO a fost de 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Aceste rezultate sunt în concordanță cu observația de la Arabidopsis conform căreia tratamentul cu KAND 11 induce depolimerizarea microtubulilor corticali (Fig. 6b). De asemenea, am examinat linia BY-2 cu filamente de actină marcate cu GFP-ABD după tratamentul cu aceeași concentrație de KAND 11 și am observat că tratamentul cu KAND 11 a perturbat filamentele de actină. Tratamentul cu 50 μM sau 100 μM KAND 11 timp de 1 oră a redus semnificativ densitatea filamentelor de actină la 1,20 ± 0,62% sau respectiv 0,61 ± 0,26%, în timp ce densitatea în celulele tratate cu DMSO a fost de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Aceste rezultate contrastează cu efectele propizamidei, care nu afectează filamentele de actină, și ale latrunculinei B, un depolimerizator de actină care nu afectează microtubulii (Figura S6 din figura S6). În plus, tratamentul cu cumamonamidă 1, acid cumamonamidic 6 sau KAND 11 nu a afectat microtubulii din celulele HeLa (Figura S7 din figura S7 din figura S7). Astfel, se consideră că mecanismul de acțiune al KAND 11 este diferit de cel al perturbatorilor citoscheletici cunoscuți. În plus, observația noastră microscopică a celulelor BY-2 tratate cu KAND 11 a relevat debutul morții celulare în timpul tratamentului cu KAND 11 și a arătat că proporția de celule moarte colorate cu albastru Evans nu a crescut semnificativ după 30 de minute de tratament cu KAND 11, în timp ce după 90 de minute de tratament cu 50 μM sau 100 μM KAND, numărul de celule moarte a crescut la 43,7%, respectiv 80,1% (Fig. 7c). Luate împreună, aceste date indică faptul că noul derivat de acid ursolic KAND 11 este un inhibitor citoscheletal specific plantelor, cu un mecanism de acțiune necunoscut anterior.
KAND afectează microtubulii corticali, filamentele de actină și viabilitatea celulelor BY-2 din tutun. (a) Vizualizarea microtubulilor corticali în celulele BY-2 în prezența TagRFP-TUA6. Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie confocală. Densitatea microtubulilor corticali a fost calculată din micrografiile a 25 de celule independente. Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05). Scara de scalare = 10 µm. (b) Filamente de actină corticală în celulele BY-2 vizualizate în prezența GFP-ABD2. Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie confocală. Densitatea filamentelor de actină corticală a fost calculată din micrografiile a 25 de celule independente. Literele indică diferențe semnificative (testul Tukey HSD, p< 0,05). Bara de scală = 10 µm. (c) Observarea celulelor BY-2 moarte prin colorare cu albastru Evans. Celulele BY-2 tratate cu KAND 11 (50 μM sau 100 μM) sau DMSO au fost examinate prin microscopie în câmp luminos. n=3. Bara de scală = 100 µm.
Descoperirea și aplicarea de noi produse naturale a condus la progrese semnificative în diverse aspecte ale vieții umane, inclusiv în medicină și agricultură. Au fost efectuate cercetări istorice pentru a obține compuși utili din resurse naturale. În special, actinomicetele sunt cunoscute ca fiind utile ca antibiotice antiparazitare pentru nematode datorită capacității lor de a produce diverși metaboliți secundari, cum ar fi avermectina, compusul principal al ivermectinei și bleomicina și derivații acesteia, utilizați în medicină ca agent anticancerigen21,22. De asemenea, o varietate de compuși erbicizi au fost descoperiți din actinomicete, dintre care unii sunt deja utilizați comercial1,23. Prin urmare, analiza metaboliților actinomicetelor pentru a izola produse naturale cu activități biologice dorite este considerată o strategie eficientă. În acest studiu, am descoperit un nou compus, cumamonamida, din S. werraensis și l-am sintetizat cu succes. Acidul ursonic este un intermediar sintetic al urbenamidei și derivaților acesteia. Acesta poate provoca ondularea caracteristică a rădăcinilor, poate prezenta o activitate erbicidă moderată până la puternică și poate deteriora direct sau indirect microtubulii plantelor. Cu toate acestea, mecanismul de acțiune al acidului urmotonic poate diferi de cel al inhibitorilor microtubuli existenți, deoarece KAND 11 perturbă, de asemenea, filamentele de actină și provoacă moartea celulară, sugerând un mecanism de reglare prin care acidul urmotonic și derivații săi influențează o gamă largă de structuri citoscheletice.
O caracterizare detaliată suplimentară a acidului urbenonic va ajuta la o mai bună înțelegere a mecanismului de acțiune al acidului urbenonic. În special, următorul obiectiv este de a evalua capacitatea acidului ursonic de a se lega de microtubulii reduși pentru a determina dacă acidul ursonic și derivații săi acționează direct asupra microtubulilor și îi depolimerizează sau dacă acțiunea lor are ca rezultat destabilizarea microtubulilor. În plus, în cazul în care microtubulii nu sunt o țintă directă, identificarea locului de acțiune și a țintelor moleculare ale acidului ursonic asupra celulelor vegetale va ajuta la înțelegerea mai bună a proprietăților compușilor înrudiți și a posibilelor modalități de îmbunătățire a activității erbicide. Testul nostru de bioactivitate a relevat capacitatea citotoxică unică a acidului ursonic asupra creșterii plantelor precum Arabidopsis thaliana, tutun și hepatică, în timp ce nici E. coli, nici celulele HeLa nu au fost afectate. Toxicitatea redusă sau deloc pentru celulele animale este un avantaj al derivaților de acid ursonic dacă sunt dezvoltați ca erbicide pentru utilizare în câmpuri agricole deschise. Într-adevăr, deoarece microtubulii sunt structuri comune la eucariote, inhibarea lor selectivă în plante este o cerință cheie pentru erbicide. De exemplu, propizamida, un agent de depolimerizare a microtubulilor care se leagă direct de tubulină și inhibă polimerizarea, este utilizată ca erbicid datorită toxicității sale scăzute pentru celulele animale24. Spre deosebire de disopiramidă, benzamidele înrudite au specificități țintă diferite. Pe lângă microtubulii plantelor, RH-4032 sau benzoxamida inhibă, de asemenea, microtubulii celulelor animale sau, respectiv, oomicetele, iar zalilamida este utilizată ca fungicid datorită fitotoxicității sale scăzute25,26,27. Ursul nou descoperit și derivații săi prezintă citotoxicitate selectivă împotriva plantelor, dar este demn de remarcat faptul că modificări ulterioare pot altera specificitatea țintei lor, oferind potențial derivați suplimentari pentru controlul fungilor patogeni sau al oomicetelor.
Proprietățile unice ale acidului urbenonic și ale derivaților săi sunt utile pentru dezvoltarea lor ca erbicide și utilizarea lor ca instrumente de cercetare. Importanța citoscheletului în controlul formei celulelor vegetale este larg recunoscută. Studiile anterioare au arătat că plantele au dezvoltat mecanisme complexe de organizare a microtubulilor corticali prin controlul dinamicii microtubulilor pentru a controla corect morfogeneza. Au fost identificate un număr mare de molecule responsabile de reglarea activității microtubulilor, iar cercetările aferente sunt încă în curs de desfășurare3,4,28. Înțelegerea noastră actuală a dinamicii microtubulilor din celulele vegetale nu explică pe deplin mecanismele de organizare a microtubulilor corticali. De exemplu, deși atât disopiramida, cât și orizalina pot depolimeriza microtubulii, disopiramida provoacă distorsiuni severe ale rădăcinilor, în timp ce orizalina are un efect relativ ușor. Mai mult, mutațiile tubulinei, care stabilizează microtubulii, provoacă și dextrorotație la rădăcini, în timp ce paclitaxelul, care stabilizează și dinamica microtubulilor, nu o face. Prin urmare, studierea și identificarea țintelor moleculare ale acidului ursolic ar trebui să ofere noi perspective asupra reglării microtubulilor corticali ai plantelor. De asemenea, comparațiile viitoare între substanțele chimice eficiente în promovarea creșterii distorsionate, cum ar fi disopiramida, și substanțele chimice mai puțin eficiente, cum ar fi orizalina sau acidul kumamotoric, vor oferi indicii despre modul în care apare creșterea distorsionată.
Pe de altă parte, rearanjările citoscheletale legate de apărare reprezintă o altă posibilitate de a explica citotoxicitatea acidului ursonic. Infecția cu un agent patogen sau introducerea unui elicitor în celulele plantelor provoacă uneori distrugerea citoscheletului și moartea celulară ulterioară29. De exemplu, s-a raportat că criptoxantina derivată din oomicete perturbă microtubulii și filamentele de actină înainte de moartea celulelor de tutun, similar cu ceea ce se întâmplă în cazul tratamentului KAND30,31. Asemănările dintre răspunsurile de apărare și răspunsurile celulare induse de acidul ursonic ne-au determinat să emitem ipoteza că acestea declanșează procese celulare comune, deși este evident un efect mai rapid și mai puternic al acidului ursonic decât al criptoxantinei. Cu toate acestea, studiile au arătat că perturbarea filamentelor de actină promovează moartea celulară spontană, care nu este întotdeauna însoțită de perturbarea microtubulilor29. În plus, rămâne de văzut dacă fie agentul patogen, fie elicitorul provoacă o creștere distorsionată a rădăcinilor, așa cum fac derivații acidului ursonic. Astfel, cunoștințele moleculare care leagă răspunsurile de apărare și citoschelet reprezintă o problemă atractivă care trebuie abordată. Prin exploatarea prezenței compușilor cu greutate moleculară mică înrudiți cu acidul ursonic, precum și a unei game de derivați cu potențe variabile, aceștia pot oferi oportunități de a viza mecanisme celulare necunoscute.
Luate împreună, descoperirea și aplicarea de noi compuși care modulează dinamica microtubulilor vor oferi metode puternice pentru a aborda mecanismele moleculare complexe care stau la baza determinării formei celulelor vegetale. În acest context, compusul recent dezvoltat, acidul urmotonic, care afectează microtubulii și filamentele de actină și induce moartea celulară, ar putea oferi o oportunitate de a descifra legătura dintre controlul microtubulilor și aceste alte mecanisme. Astfel, analiza chimică și biologică utilizând acidul urbenonic ne va ajuta să înțelegem mecanismele de reglare moleculară care controlează citoscheletul plantei.
Se inoculează S. werraensis MK493-CF1 într-un balon Erlenmeyer cu șicane de 500 ml, conținând 110 ml de mediu de însămânțare constând din 2% (g/v) galactoză, 2% (g/v) pastă Essence, 1% (g/v) compoziție Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (g/v) extract de porumb (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonia), 0,2% (g/v) (NH4)2SO4 și 0,2% CaCO3 în apă deionizată (pH 7,4 înainte de sterilizare). Culturile de însămânțare au fost incubate pe un agitator rotativ (180 rpm) la 27°C timp de 2 zile. Cultivare prin fermentație în stare solidă. Cultura de semințe (7 ml) a fost transferată într-un balon K-1 de 500 ml conținând 40 g de mediu de producție, constând din 15 g de orz presat (MUSO Co., Ltd., Japonia) și 25 g de apă deionizată (pH-ul nu a fost ajustat înainte de sterilizare). Fermentația a fost efectuată la 30°C la întuneric timp de 14 zile. Materialul de fermentație a fost extras cu 40 ml/sticlă de EtOH și centrifugat (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatantul culturii (60 ml) a fost extras cu un amestec de 10% MeOH/EtOAc. Stratul organic a fost evaporat sub presiune redusă pentru a obține un reziduu (59,5 mg), care a fost supus HPLC cu eluție în gradient (0–10 minute: 90%) pe o coloană cu fază inversă (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lungime 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minute: 90% H2O/CH3CN până la 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minute: 90% H2O/EtOH, 45–155 minute: 90% H2O/EtOH până la 100% EtOH (gradient, 155–200 min: 100% EtOH) la un debit de 1,5 ml/min, cumamonamida (1, 36,0 mg) a fost izolată sub formă de pulbere amorfă albă.
Kumamotoamidă(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valoare calculată: 141,0659, valoare măsurată: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semințele Columbia (Col-0) au fost obținute de la Centrul de Resurse Biologice Arabidopsis (ABRC) cu permisiunea de utilizare în cercetare. Semințele Col-0 au fost propagate și întreținute în condițiile noastre de laborator și utilizate ca plante Arabidopsis de tip sălbatic. Semințele Arabidopsis au fost sterilizate la suprafață și cultivate în mediu Murashige și Skoog cu concentrație redusă, conținând 2% zaharoză (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (g/v) acid 2-(4-morfolino)etansulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) și 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, la 23 °C și lumină constantă. Semințele mutantului phs1-1 au fost furnizate de T. Hashimoto (Institutul de Știință și Tehnologie Nara).
Semințele din tulpina SR-1 au fost furnizate de T. Hashimoto (Institutul de Știință și Tehnologie Nara) și utilizate ca plante de tutun de tip sălbatic. Semințele de tutun au fost sterilizate la suprafață și înmuiate în apă sterilă timp de trei nopți pentru a promova germinarea, apoi plasate într-o soluție cu concentrație redusă conținând 2% zaharoză, 0,05% (g/v) MES și 0,8% gumă gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) (mediu Murashige și Skoog) cu pH 5,7 și incubate la 23°C sub lumină constantă.
Tulpina Tak-1 a fost furnizată de T. Kohchi (Universitatea Kyoto) și a fost utilizată ca unitate experimentală standard pentru studiul hepaticelor. Gemma a fost obținută din plante cultivate sterilizate și apoi plantată pe mediu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) conținând 1% zaharoză și 0,3% gumă gellan și incubată la 23°C sub lumină continuă.
Celulele BY-2 din tutun (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) au fost furnizate de S. Hasezawa (Universitatea din Tokyo). Celulele BY-2 au fost diluate de 95 de ori în mediu Linsmeier și Skoog modificat și suplimentate săptămânal cu acid 2,4-diclorofenoxiacetic 32. Suspensia celulară a fost amestecată pe un agitator rotativ la 130 rpm la 27°C, la întuneric. Spălați celulele cu un volum de 10 ori mai mare de mediu proaspăt și resuspendați în același mediu. Liniile celulare transgenice BY-2 care exprimă stabil markerul de microtubuli TagRFP-TUA6 sau markerul de filament de actină GFP-ABD2 sub promotorul 35S al virusului mozaicului conopidei au fost generate așa cum este descris 33,34,35. Aceste linii celulare pot fi menținute și sincronizate folosind proceduri similare cu cele utilizate pentru linia celulară BY-2 originală.
Celulele HeLa au fost cultivate în mediu Dulbecco modificat de Eagle (DMEM) (Life Technologies) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 1,2 U/ml penicilină și 1,2 μg/ml streptomicină într-un incubator la 37°C cu 5% CO2.
Toate experimentele descrise în acest manuscris au fost efectuate în conformitate cu reglementările și directivele japoneze privind biosecuritatea.
Compușii au fost dizolvați în dimetilsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ca soluții stoc și diluați în mediu MS pentru Arabidopsis și tutun sau mediu Gamborg B5 pentru hepatică. Pentru testul de inhibare a creșterii rădăcinilor, mai mult de 10 semințe pe placă au fost semănate pe mediu agar conținând compușii indicați sau DMSO. Semințele au fost incubate într-o cameră de creștere timp de 7 zile. Răsadurile au fost fotografiate și lungimea rădăcinilor a fost măsurată. Pentru testul de germinare a Arabidopsis, 48 de semințe pe placă au fost semănate pe mediu agar conținând 200 μM compus sau DMSO. Semințele de Arabidopsis au fost cultivate într-o cameră de creștere, iar numărul de răsaduri germinate a fost numărat la 7 zile după germinare (zile). Pentru testul de germinare a tutunului, 24 de semințe pe placă au fost semănate pe mediu agar conținând 200 μM KAND sau DMSO. Semințele de tutun au fost cultivate într-o cameră de creștere, iar numărul de răsaduri germinate a fost numărat după 14 zile. Pentru testul de inhibare a creșterii hepaticelor, 9 embrioni din fiecare placă au fost plantați pe mediu de agar conținând concentrațiile indicate de KAND sau DMSO și incubați într-o cameră de creștere timp de 14 zile.
S-au folosit răsaduri colorate cu 5 mg/ml iodură de propidiu (PI) pentru a vizualiza organizarea meristemului radicular. Semnalele PI au fost observate prin microscopie cu fluorescență utilizând un microscop confocal cu scanare laser TCS SPE (Leica Microsystems).
Colorația histochimică a rădăcinilor cu β-glucuronidază (GUS) a fost efectuată conform protocolului descris de Malami și Benfey36. Răsadurile au fost fixate peste noapte în acetonă 90%, colorate cu 0,5 mg/ml acid 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucuronic în tampon GUS timp de 1 oră și plasate într-o soluție de cloraldehidă hidratată (8 g hidrat de cloral, 2 ml apă și 1 ml glicerol) și observate prin microscopie cu contrast interferențial utilizând un microscop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Unghiurile rădăcinilor au fost măsurate pe răsaduri în vârstă de 7 zile, cultivate pe plăci plasate vertical. Măsurați unghiul rădăcinii față de direcția vectorului gravitațional, așa cum este descris în pasul 6.
Aranjamentul microtubulilor corticali a fost observat așa cum este descris, cu modificări minore ale protocolului 37. Anticorpul anti-β-tubulină (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) și IgG anti-șoarece conjugat cu Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) au fost utilizați ca anticorpi primari și secundari la diluții de 1:1000 și respectiv 1:100. Imaginile cu fluorescență au fost achiziționate utilizând un microscop confocal cu scanare laser TCS SPE (Leica Microsystems). Achiziționați imagini Z-stack și creați proiecții de intensitate maximă conform instrucțiunilor producătorului.
Testul de proliferare a celulelor HeLa a fost efectuat utilizând Cell Counting Kit 8 (Dojindo) conform instrucțiunilor producătorului.
Creșterea E. coli DH5α a fost analizată prin măsurarea densității celulare în cultură utilizând un spectrofotometru la 600 nm (OD600).
Organizarea citoscheletului în celulele transgenice BY-2 a fost observată utilizând un microscop cu fluorescență echipat cu un dispozitiv de scanare confocală CSU-X1 (Yokogawa) și o cameră sCMOS (Zyla, Andor Technology). Densitatea citoscheletului a fost evaluată prin analiza imaginilor, care a cuantificat procentul de pixeli citoscheletali printre pixelii citoplasmatici din imaginile confocale utilizând software-ul ImageJ așa cum este descris38,39.
Pentru a detecta moartea celulară în celulele BY-2, o alicotă din suspensia celulară a fost incubată cu 0,05% albastru Evans timp de 10 minute la temperatura camerei. Colorarea selectivă cu albastru Evans a celulelor moarte depinde de extrudarea colorantului din celulele viabile de către membrana plasmatică intactă40. Celulele colorate au fost observate folosind un microscop cu câmp luminos (BX53, Olympus).
Celulele HeLa au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS într-un incubator umidificat la 37°C și 5% CO2. Celulele au fost tratate cu 100 μM KAND 11, acid kumamonamic 6, kumamonamidă 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) sau 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) timp de 6 ore la 37°C. Celulele au fost fixate cu MetOH timp de 10 minute și apoi cu acetat timp de 5 minute la temperatura camerei. Celulele fixate au fost incubate cu anticorp primar β-tubulină (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluat în 0,5% BSA/PBS timp de 2 ore, spălate de 3 ori cu TBST și apoi incubate cu anticorp de capră Alexa Fluor. 488 timp de 1 oră. – IgG de șoarece (Thermo Fisher Scientific: A11001) și 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluat în 0,5% BSA/PBS. După spălarea cu TBST de trei ori, celulele colorate au fost observate la un microscop inversat Nikon Eclipse Ti-E. Imaginile au fost capturate cu o cameră CCD Hamamatsu ORCA-R2 răcită, utilizând software-ul MetaMorph (Molecular Devices).
Data publicării: 17 iunie 2024