Pentru a fi eficientcontrolul țânțarilorși pentru a reduce incidența bolilor pe care le transmit, sunt necesare alternative strategice, sustenabile și ecologice la pesticidele chimice. Am evaluat făinurile de semințe de la anumite Brassicaceae (familia Brassica) ca sursă de izotiocianați derivați din plante, produși prin hidroliza enzimatică a glucozinolaților biologic inactivi, pentru utilizare în controlul speciei Aedes egiptene (L., 1762). Făină de semințe degresate cu cinci straturi (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 și Thlaspi arvense – trei tipuri principale de inactivare termică și degradare enzimatică. Produse chimice. Pentru a determina toxicitatea (LC50) a izotiocianatului de alil, izotiocianatului de benzil și 4-hidroxibenzilizotiocianatului la larvele de Aedes aegypti la o expunere de 24 de ore = 0,04 g/120 ml dH2O). Valorile LC50 pentru muștar, muștar alb și coada-calului. Șoiul de semințe a fost de 0,05, 0,08 și respectiv 0,05 în comparație cu izotiocianatul de alil (LC50 = 19,35 ppm) și 4.-Hidroxibenzilizotiocianatul (LC50 = 55,41 ppm) a fost mai toxic pentru larve la 24 de ore după tratament decât 0,1 g/120 ml dH2O, respectiv. Aceste rezultate sunt în concordanță cu producția de șoi de semințe de lucernă. Eficiența mai mare a esterilor benzilici corespunde valorilor LC50 calculate. Utilizarea șoiului de semințe poate oferi o metodă eficientă de control al țânțarilor. a demonstrat eficacitatea pulberii de semințe de crucifere și a principalelor sale componente chimice împotriva larvelor de țânțari și arată cum compușii naturali din pulberea de semințe de crucifere pot servi drept larvicid promițător și ecologic pentru controlul țânțarilor.
Bolile transmise prin vectori cauzate de țânțarii Aedes rămân o problemă majoră de sănătate publică la nivel global. Incidența bolilor transmise de țânțari se răspândește geografic1,2,3 și reapare, ducând la focare de boli grave4,5,6,7. Răspândirea bolilor în rândul oamenilor și animalelor (de exemplu, chikungunya, dengue, febra Rift Valley, febra galbenă și virusul Zika) este fără precedent. Numai febra dengue pune aproximativ 3,6 miliarde de oameni în pericol de infecție în zonele tropicale, cu o estimare de 390 de milioane de infecții anual, rezultând între 6.100 și 24.300 de decese pe an8. Reapariția și izbucnirea virusului Zika în America de Sud au atras atenția la nivel mondial datorită leziunilor cerebrale pe care le provoacă la copiii născuți din femei infectate2. Kremer și colab.3 prevăd că aria geografică a țânțarilor Aedes va continua să se extindă și că, până în 2050, jumătate din populația lumii va fi expusă riscului de infecție cu arbovirusuri transmise de țânțari.
Cu excepția vaccinurilor recent dezvoltate împotriva febrei dengue și a febrei galbene, vaccinurile împotriva majorității bolilor transmise de țânțari nu au fost încă dezvoltate9,10,11. Vaccinurile sunt încă disponibile în cantități limitate și sunt utilizate doar în studii clinice. Controlul vectorilor de țânțari folosind insecticide sintetice a fost o strategie cheie pentru controlul răspândirii bolilor transmise de țânțari12,13. Deși pesticidele sintetice sunt eficiente în uciderea țânțarilor, utilizarea continuă a pesticidelor sintetice afectează negativ organismele nevizate și poluează mediul14,15,16. Și mai alarmantă este tendința de creștere a rezistenței țânțarilor la insecticidele chimice17,18,19. Aceste probleme asociate cu pesticidele au accelerat căutarea unor alternative eficiente și ecologice pentru controlul vectorilor de boli.
Diverse plante au fost dezvoltate ca surse de fitopesticide pentru combaterea dăunătorilor20,21. Substanțele vegetale sunt în general ecologice, deoarece sunt biodegradabile și au o toxicitate scăzută sau neglijabilă pentru organismele nevizate, cum ar fi mamiferele, peștii și amfibienii20,22. Preparatele din plante sunt cunoscute pentru faptul că produc o varietate de compuși bioactivi cu mecanisme de acțiune diferite pentru a controla eficient diferitele etape de viață ale țânțarilor23,24,25,26. Compușii derivați din plante, cum ar fi uleiurile esențiale și alte ingrediente active din plante, au atras atenția și au deschis calea pentru instrumente inovatoare de control al vectorilor țânțarilor. Uleiurile esențiale, monoterpenele și sescviterpenele acționează ca repelenți, factori de descurajare a hrănirii și ovicide27,28,29,30,31,32,33. Multe uleiuri vegetale provoacă moartea larvelor, pupelor și adulților de țânțari34,35,36, afectând sistemele nervos, respirator, endocrin și alte sisteme importante ale insectelor37.
Studii recente au oferit informații despre potențialul de utilizare a plantelor de muștar și a semințelor acestora ca sursă de compuși bioactivi. Șoiul din semințe de muștar a fost testat ca biofumigant38,39,40,41 și utilizat ca amendament pentru sol pentru suprimarea buruienilor42,43,44 și controlul agenților patogeni ai plantelor din sol45,46,47,48,49,50, nutriția plantelor, nematode41,51, 52, 53, 54 și dăunători55, 56, 57, 58, 59, 60. Activitatea fungicidă a acestor pulberi de semințe este atribuită compușilor protectori ai plantelor numiți izotiocianați38,42,60. La plante, acești compuși protectori sunt stocați în celulele plantelor sub formă de glucozinolați non-bioactivi. Cu toate acestea, atunci când plantele sunt deteriorate de hrănirea cu insecte sau de infecția cu agenți patogeni, glucozinolații sunt hidrolizați de mirozinază în izotiocianați bioactivi55,61. Izotiocianații sunt compuși volatili cunoscuți pentru activitatea antimicrobiană și insecticidă cu spectru larg, iar structura, activitatea biologică și conținutul lor variază foarte mult între speciile de Brassicaceae42,59,62,63.
Deși se știe că izotiocianații derivați din făina de semințe de muștar au activitate insecticidă, datele privind activitatea biologică împotriva vectorilor artropode importanți din punct de vedere medical lipsesc. Studiul nostru a examinat activitatea larvicidă a patru pulberi de semințe degresate împotriva țânțarilor Aedes. Larve de Aedes aegypti. Scopul studiului a fost de a evalua potențialul lor de utilizare ca biopesticide ecologice pentru controlul țânțarilor. Trei componente chimice majore ale făinii de semințe, izotiocianatul de alil (AITC), izotiocianatul de benzil (BITC) și 4-hidroxibenzilizotiocianatul (4-HBITC) au fost, de asemenea, testate pentru a testa activitatea biologică a acestor componente chimice asupra larvelor de țânțari. Acesta este primul raport care evaluează eficacitatea a patru pulberi de semințe de varză și a principalelor lor componente chimice împotriva larvelor de țânțari.
Coloniile de laborator de Aedes aegypti (tulpina Rockefeller) au fost menținute la 26°C, umiditate relativă (RH) de 70% și 10:14 h (fotoperioadă L:D). Femelele împerecheate au fost adăpostite în cuști din plastic (înălțime 11 cm și diametru 9,5 cm) și hrănite printr-un sistem de hrănire cu biberon, folosind sânge bovin citrat (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, SUA). Hrănirea cu sânge s-a efectuat ca de obicei, folosind un alimentator multi-sticlă cu membrană (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, SUA) conectat la un tub de baie de apă circulantă (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, SUA) cu controlul temperaturii la 37°C. Se întinde o peliculă de Parafilm M pe fundul fiecărei camere de alimentare din sticlă (suprafață 154 mm2). Fiecare alimentator a fost apoi plasat pe grila superioară care acoperă cușca care conține femela împerecheată. Aproximativ 350–400 μl de sânge bovin au fost adăugați într-o pâlnie de alimentare din sticlă folosind o pipetă Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA), iar viermii adulți au fost lăsați să se scurgă timp de cel puțin o oră. Femelelor gestante li s-a administrat apoi o soluție de zaharoză 10% și li s-a permis să depună ouă pe hârtie de filtru umedă, căptușită în cupe individuale ultra-clare pentru sufleu (1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, SUA). Se pune hârtia de filtru care conține ouăle într-o pungă sigilată (SC Johnsons, Racine, WI) și se depozitează la 26°C. Ouăle au fost eclozate și aproximativ 200–250 de larve au fost crescute în tăvi de plastic care conțineau un amestec de hrană pentru iepuri (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, SUA) și pudră de ficat (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, SUA) și file de pește (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Germania) într-un raport de 2:1:1. Larvele de la sfârșitul celui de-al treilea stadiu incipient au fost utilizate în biotestele noastre.
Materialul semințel utilizat în acest studiu a fost obținut din următoarele surse comerciale și guvernamentale: Brassica juncea (muștar brun - Pacific Gold) și Brassica juncea (muștar alb - Ida Gold) de la Pacific Northwest Farmers' Cooperative, statul Washington, SUA; (Garden Cress) de la Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, SUA și Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) de la USDA-ARS, Peoria, IL, SUA; Niciuna dintre semințele utilizate în studiu nu a fost tratată cu pesticide. Toate semințele au fost procesate și utilizate în acest studiu în conformitate cu reglementările locale și naționale și în conformitate cu toate reglementările locale, statale și naționale relevante. Acest studiu nu a examinat soiuri de plante transgenice.
Semințele de Brassica juncea (PG), Lucernă (Ls), Muștar alb (IG) și Thlaspi arvense (DFP) au fost măcinate până la o pulbere fină folosind o moară ultracentrifugă Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Germania) echipată cu o plasă de 0,75 mm și rotor din oțel inoxidabil, 12 dinți, 10.000 rpm (Tabelul 1). Pulberea de semințe măcinată a fost transferată într-un degetar de hârtie și degresată cu hexan într-un aparat Soxhlet timp de 24 de ore. O subprobă de muștar de câmp degresat a fost tratată termic la 100 °C timp de 1 oră pentru a denatura mirosinaza și a preveni hidroliza glucozinolaților pentru a forma izotiocianați biologic activi. Pulberea de semințe de coada-calului tratată termic (DFP-HT) a fost utilizată ca și control negativ prin denaturarea mirosinazei.
Conținutul de glucozinolat al făinii de semințe degresate a fost determinat în triplicat utilizând cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), conform unui protocol publicat anterior 64. Pe scurt, s-au adăugat 3 ml de metanol la o probă de 250 mg de pulbere de semințe degresate. Fiecare probă a fost sonicizată într-o baie de apă timp de 30 de minute și lăsată la întuneric la 23°C timp de 16 ore. O alicotă de 1 ml din stratul organic a fost apoi filtrată printr-un filtru de 0,45 μm într-un autosampler. Funcționând pe un sistem HPLC Shimadzu (două pompe LC 20AD; autosampler SIL 20A; degazer DGU 20As; detector UV-VIS SPD-20A pentru monitorizare la 237 nm; și modul de magistrală de comunicație CBM-20A), conținutul de glucozinolat al făinii de semințe a fost determinat în triplicat utilizând software-ul Shimadzu LC Solution versiunea 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, SUA). Coloana a fost o coloană cu fază inversă C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, SUA). Condițiile inițiale pentru faza mobilă au fost stabilite la 12% metanol/88% hidroxid de tetrabutilamoniu 0,01 M în apă (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) cu un debit de 1 mL/min. După injectarea a 15 μl de probă, condițiile inițiale au fost menținute timp de 20 de minute, apoi raportul solventului a fost ajustat la 100% metanol, cu un timp total de analiză a probei de 65 de minute. O curbă standard (pe bază de nM/mAb) a fost generată prin diluții seriale de standarde de sinapină, glucozinolat și mirozină proaspăt preparate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) pentru a estima conținutul de sulf al glucozinolaților de semințe degresați. Concentrațiile de glucozinolat din probe au fost testate pe un aparat HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, SUA) utilizând versiunea OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) echipată cu aceeași coloană și utilizând o metodă descrisă anterior. Concentrațiile de glucozinolat au fost determinate pentru a fi comparabile între sistemele HPLC.
Izotiocianatul de alil (94%, stabil) și izotiocianatul de benzil (98%) au fost achiziționate de la Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). 4-hidroxibenzilizotiocianatul a fost achiziționat de la ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, SUA). Când sunt hidrolizați enzimatic de mirozinază, glucozinolații, glucozinolații și glucozinolații formează izotiocianat de alil, izotiocianat de benzil și, respectiv, 4-hidroxibenzilizotiocianat.
Biotestele de laborator au fost efectuate conform metodei Muturi și colab. 32, cu modificări. În studiu s-au utilizat cinci furaje cu conținut scăzut de grăsimi pentru semințe: DFP, DFP-HT, IG, PG și Ls. Douăzeci de larve au fost plasate într-un pahar cu trei căi de unică folosință de 400 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA, SUA) conținând 120 ml de apă deionizată (dH2O). Au fost testate șapte concentrații de făină de semințe pentru toxicitatea larvară a țânțarilor: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 și 0,12 g făină de semințe/120 ml dH2O pentru făina de semințe DFP, DFP-HT, IG și PG. Biotestele preliminare indică faptul că făina de semințe Ls degresată este mai toxică decât alte patru făinuri de semințe testate. Prin urmare, am ajustat cele șapte concentrații de tratament ale făinii de semințe de Ls la următoarele concentrații: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 și 0,075 g/120 mL dH2O.
Un grup de control netratat (dH20, fără supliment de făină de semințe) a fost inclus pentru a evalua mortalitatea normală a insectelor în condițiile de analiză. Biotestele toxicologice pentru fiecare făină de semințe au inclus trei pahare repetate cu trei pahare (20 de larve de la sfârșitul stadiului al treilea per pahar), pentru un total de 108 flacoane. Recipientele tratate au fost depozitate la temperatura camerei (20-21°C), iar mortalitatea larvară a fost înregistrată timp de 24 și 72 de ore de expunere continuă la concentrațiile de tratament. Dacă corpul și fanerele țânțarului nu se mișcă atunci când sunt perforate sau atinse cu o spatulă subțire din oțel inoxidabil, larvele de țânțar sunt considerate moarte. Larvele moarte rămân de obicei nemișcate în poziție dorsală sau ventrală pe fundul recipientului sau la suprafața apei. Experimentul a fost repetat de trei ori în zile diferite, utilizând diferite grupuri de larve, pentru un total de 180 de larve expuse la fiecare concentrație de tratament.
Toxicitatea AITC, BITC și 4-HBITC asupra larvelor de țânțari a fost evaluată utilizând aceeași procedură de bioanaliză, dar cu tratamente diferite. Preparați soluții stoc de 100.000 ppm pentru fiecare substanță chimică prin adăugarea a 100 µL de substanță chimică la 900 µL de etanol absolut într-un tub de centrifugă de 2 ml și agitarea timp de 30 de secunde pentru a se amesteca bine. Concentrațiile de tratament au fost determinate pe baza bioanalizelor noastre preliminare, care au constatat că BITC este mult mai toxic decât AITC și 4-HBITC. Pentru a determina toxicitatea, au fost utilizate 5 concentrații de BITC (1, 3, 6, 9 și 12 ppm), 7 concentrații de AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 și 35 ppm) și 6 concentrații de 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 și 35 ppm). 30, 45, 60, 75 și 90 ppm). Tratamentul de control a fost injectat cu 108 μL de etanol absolut, ceea ce este echivalent cu volumul maxim al tratamentului chimic. Biotestele au fost repetate ca mai sus, expunând un total de 180 de larve per concentrație de tratament. Mortalitatea larvară a fost înregistrată pentru fiecare concentrație de AITC, BITC și 4-HBITC după 24 de ore de expunere continuă.
Analiza probit a 65 de date privind mortalitatea legată de doză a fost efectuată utilizând software-ul Polo (Polo Plus, LeOra Software, versiunea 1.0) pentru a calcula concentrația letală de 50% (LC50), concentrația letală de 90% (LC90), panta, coeficientul dozei letale și concentrația letală de 95%, pe baza intervalelor de încredere pentru raporturile dozelor letale pentru curbele de concentrație transformată logaritmic și doză-mortalitate. Datele privind mortalitatea se bazează pe date replicate combinate a 180 de larve expuse la fiecare concentrație de tratament. Analizele probabilistice au fost efectuate separat pentru fiecare făină de semințe și fiecare componentă chimică. Pe baza intervalului de încredere de 95% al raportului dozei letale, toxicitatea făinii de semințe și a constituenților chimici pentru larvele de țânțari a fost considerată a fi semnificativ diferită, astfel încât un interval de încredere care conține o valoare de 1 nu a fost semnificativ diferit, P = 0,0566.
Rezultatele HPLC pentru determinarea principalilor glucozinolați din făinurile de semințe degresate DFP, IG, PG și Ls sunt prezentate în Tabelul 1. Principalii glucozinolați din făinurile de semințe testate au variat, cu excepția DFP și PG, care ambele conțineau glucozinolați de mirozinază. Conținutul de mirozinină din PG a fost mai mare decât în DFP, 33,3 ± 1,5 și, respectiv, 26,5 ± 0,9 mg/g. Pulberea de semințe Ls conținea 36,6 ± 1,2 mg/g glucogliconă, în timp ce pulberea de semințe IG conținea 38,0 ± 0,5 mg/g sinapină.
Larvele de țânțari Aedes aegypti au fost ucise atunci când au fost tratate cu făină de semințe degresată, deși eficacitatea tratamentului a variat în funcție de specia plantei. Doar DFP-NT nu a fost toxic pentru larvele de țânțari după 24 și 72 de ore de expunere (Tabelul 2). Toxicitatea pulberii active din semințe a crescut odată cu creșterea concentrației (Fig. 1A, B). Toxicitatea făinii de semințe pentru larvele de țânțari a variat semnificativ în funcție de intervalul de încredere de 95% al raportului dozei letale dintre valorile LC50 la evaluările la 24 de ore și 72 de ore (Tabelul 3). După 24 de ore, efectul toxic al făinii de semințe Ls a fost mai mare decât al altor tratamente cu făină de semințe, cu cea mai mare activitate și toxicitate maximă pentru larve (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larvele au fost mai puțin sensibile la DFP la 24 de ore comparativ cu tratamentele cu IG, Ls și pulbere de semințe PG, cu valori LC50 de 0,115, 0,04 și respectiv 0,08 g/120 ml dH2O, care au fost statistic mai mari decât valoarea LC50 de 0,211 g/120 ml dH2O (Tabelul 3). Valorile LC90 pentru DFP, IG, PG și Ls au fost de 0,376, 0,275, 0,137 și respectiv 0,074 g/120 ml dH2O (Tabelul 2). Cea mai mare concentrație de DPP a fost de 0,12 g/120 ml dH2O. După 24 de ore de evaluare, mortalitatea medie a larvelor a fost de doar 12%, în timp ce mortalitatea medie a larvelor cu IG și PG a atins 51%, respectiv 82%. După 24 de ore de evaluare, mortalitatea larvară medie pentru tratamentul cu cea mai mare concentrație de făină de semințe de Ls (0,075 g/120 ml dH2O) a fost de 99% (Fig. 1A).
Curbele de mortalitate au fost estimate din raportul doză-răspuns (Probit) al larvelor de Ae. egipteană (larve în stadiul 3) la concentrația de făină de semințe la 24 de ore (A) și 72 de ore (B) după tratament. Linia punctată reprezintă LC50 a tratamentului cu făină de semințe. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inactivat termic, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
La evaluarea la 72 de ore, valorile LC50 pentru făina de semințe DFP, IG și PG au fost de 0,111, 0,085 și respectiv 0,051 g/120 ml dH2O. Aproape toate larvele expuse la făina de semințe Ls au murit după 72 de ore de expunere, astfel încât datele privind mortalitatea au fost inconsistente cu analiza Probit. Comparativ cu alte făini de semințe, larvele au fost mai puțin sensibile la tratamentul cu făină de semințe DFP și au avut valori LC50 statistic mai mari (Tabelele 2 și 3). După 72 de ore, valorile LC50 pentru tratamentele cu făină de semințe DFP, IG și PG au fost estimate la 0,111, 0,085 și respectiv 0,05 g/120 ml dH2O. După 72 de ore de evaluare, valorile LC90 pentru pulberile de semințe DFP, IG și PG au fost de 0,215, 0,254 și respectiv 0,138 g/120 ml dH2O. După 72 de ore de evaluare, mortalitatea medie a larvelor pentru tratamentele cu făină de semințe DFP, IG și PG la o concentrație maximă de 0,12 g/120 ml dH2O a fost de 58%, 66% și respectiv 96% (Fig. 1B). După o evaluare de 72 de ore, s-a constatat că făina de semințe PG este mai toxică decât făina de semințe IG și DFP.
Izotiocianații sintetici, izotiocianatul de alil (AITC), izotiocianatul de benzil (BITC) și 4-hidroxibenzilizotiocianatul (4-HBITC) pot ucide eficient larvele de țânțari. La 24 de ore după tratament, BITC a fost mai toxic pentru larve, cu o valoare LC50 de 5,29 ppm comparativ cu 19,35 ppm pentru AITC și 55,41 ppm pentru 4-HBITC (Tabelul 4). Comparativ cu AITC și BITC, 4-HBITC are o toxicitate mai mică și o valoare LC50 mai mare. Există diferențe semnificative în ceea ce privește toxicitatea larvară a țânțarilor în cazul celor doi izotiocianați principali (Ls și PG) în cea mai puternică făină de semințe. Toxicitatea bazată pe raportul dozei letale dintre valorile LC50 ale AITC, BITC și 4-HBITC a arătat o diferență statistică astfel încât intervalul de încredere de 95% al raportului dozei letale LC50 nu a inclus o valoare de 1 (P = 0,05, Tabelul 4). S-a estimat că cele mai mari concentrații atât de BITC, cât și de AITC ucid 100% dintre larvele testate (Figura 2).
Curbele de mortalitate au fost estimate din raportul doză-răspuns (Probit) al Ae. La 24 de ore după tratament, larvele egiptene (larve în stadiul 3) au atins concentrații de izotiocianat sintetic. Linia punctată reprezintă LC50 pentru tratamentul cu izotiocianat. Izotiocianat de benzil BITC, izotiocianat de alil AITC și 4-HBITC.
Utilizarea biopesticidelor vegetale ca agenți de control al vectorilor țânțarilor a fost studiată de mult timp. Multe plante produc substanțe chimice naturale care au activitate insecticidă37. Compușii lor bioactivi oferă o alternativă atractivă insecticidelor sintetice, cu un mare potențial în controlul dăunătorilor, inclusiv al țânțarilor.
Plantele de muștar sunt cultivate pentru semințele lor, folosite ca și condiment și sursă de ulei. Atunci când uleiul de muștar este extras din semințe sau când muștarul este extras pentru a fi utilizat drept biocombustibil,69 produsul secundar este făina degresată. Această făină de semințe își păstrează multe dintre componentele biochimice naturale și enzimele hidrolitice. Toxicitatea acestei făini de semințe este atribuită producției de izotiocianați55,60,61. Izotiocianații se formează prin hidroliza glucozinolaților de către enzima mirozinază în timpul hidratării făinii de semințe38,55,70 și sunt cunoscuți pentru efectele fungicide, bactericide, nematicide și insecticide, precum și alte proprietăți, inclusiv efecte senzoriale chimice și proprietăți chimioterapeutice61,62,70. Mai multe studii au arătat că plantele de muștar și făina de semințe acționează eficient ca fumiganți împotriva dăunătorilor alimentari ai solului și ai depozitării57,59,71,72. În acest studiu, am evaluat toxicitatea făinii din patru semințe și a celor trei produse bioactivi ai săi, AITC, BITC și 4-HBITC, asupra larvelor de țânțari Aedes aegypti. Se așteaptă ca adăugarea făinii din semințe direct în apa care conține larve de țânțari să activeze procesele enzimatice care produc izotiocianați toxici pentru larvele de țânțari. Această biotransformare a fost demonstrată parțial prin activitatea larvicidă observată a făinii din semințe și prin pierderea activității insecticide atunci când făina din semințe de muștar pitic a fost tratată termic înainte de utilizare. Se așteaptă ca tratamentul termic să distrugă enzimele hidrolitice care activează glucozinolații, prevenind astfel formarea de izotiocianați bioactivi. Acesta este primul studiu care confirmă proprietățile insecticide ale pulberii de semințe de varză împotriva țânțarilor într-un mediu acvatic.
Printre pulberile de semințe testate, pulberea de semințe de năsturel (Ls) a fost cea mai toxică, provocând o mortalitate ridicată a larvelor de Aedes albopictus. Larvele de Aedes aegypti au fost procesate continuu timp de 24 de ore. Celelalte trei pulberi de semințe (PG, IG și DFP) au avut o activitate mai lentă și au cauzat totuși o mortalitate semnificativă după 72 de ore de tratament continuu. Doar făina de semințe Ls conținea cantități semnificative de glucozinolați, în timp ce PG și DFP conțineau mirozinază, iar IG conținea glucozinolat ca glucozinolat principal (Tabelul 1). Glucotropeolina este hidrolizată la BITC, iar sinalbina este hidrolizată la 4-HBITC61,62. Rezultatele noastre bioteste indică faptul că atât făina de semințe Ls, cât și BITC sintetic sunt foarte toxice pentru larvele de țânțari. Componenta principală a făinii de semințe de PG și DFP este glucozinolatul de mirozinază, care este hidrolizat la AITC. AITC este eficient în uciderea larvelor de țânțari, cu o valoare LC50 de 19,35 ppm. Comparativ cu AITC și BITC, izotiocianatul de 4-HBITC este cel mai puțin toxic pentru larve. Deși AITC este mai puțin toxic decât BITC, valorile LC50 ale acestora sunt mai mici decât cele ale multor uleiuri esențiale testate pe larve de țânțari32,73,74,75.
Pulberea noastră de semințe de crucifere, utilizată împotriva larvelor de țânțari, conține un glucozinolat major, reprezentând peste 98-99% din totalul glucozinolaților, determinat prin HPLC. Au fost detectate urme de alți glucozinolați, dar nivelurile acestora au fost mai mici de 0,3% din totalul glucozinolaților. Pulberea de semințe de năsturel (L. sativum) conține glucozinolați secundari (sinigrină), dar proporția acestora este de 1% din totalul glucozinolaților, iar conținutul lor este încă nesemnificativ (aproximativ 0,4 mg/g pulbere de semințe). Deși PG și DFP conțin același glucozinolat principal (mirozină), activitatea larvicidă a făinurilor lor de semințe diferă semnificativ datorită valorilor lor LC50. Variază în ceea ce privește toxicitatea față de făinarea praf. Apariția larvelor de Aedes aegypti se poate datora diferențelor în activitatea mirozinazei sau stabilității dintre cele două furaje. Activitatea mirosinazei joacă un rol important în biodisponibilitatea produșilor de hidroliză, cum ar fi izotiocianații, la plantele Brassicaceae76. Rapoartele anterioare ale lui Pocock și colab.77 și Wilkinson și colab.78 au arătat că modificările activității și stabilității mirosinazei pot fi, de asemenea, asociate cu factori genetici și de mediu.
Conținutul așteptat de izotiocianat bioactiv a fost calculat pe baza valorilor LC50 ale fiecărei făini la 24 și 72 de ore (Tabelul 5) pentru comparație cu aplicațiile chimice corespunzătoare. După 24 de ore, izotiocianații din făina de semințe au fost mai toxici decât compușii puri. Valorile LC50 calculate pe baza tratamentelor cu izotiocianat în părți per milion (ppm) au fost mai mici decât valorile LC50 pentru aplicațiile BITC, AITC și 4-HBITC. Am observat larve consumând pelete de făină de semințe (Figura 3A). În consecință, larvele pot fi expuse mai concentrat la izotiocianați toxici prin ingerarea peletelor de făină de semințe. Acest lucru a fost cel mai evident în cazul tratamentelor cu făină de semințe IG și PG la expunerea de 24 de ore, unde concentrațiile LC50 au fost cu 75% și 72% mai mici decât în cazul tratamentelor cu AITC pur și 4-HBITC, respectiv. Tratamentele cu Ls și DFP au fost mai toxice decât izotiocianatul pur, cu valori LC50 cu 24% și respectiv 41% mai mici. Larvele din tratamentul de control s-au transformat cu succes în pupe (Fig. 3B), în timp ce majoritatea larvelor din tratamentul cu făină de semințe nu s-au transformat în pupe, iar dezvoltarea larvară a fost semnificativ întârziată (Fig. 3B, D). La Spodopteralitura, izotiocianații sunt asociați cu întârzierea creșterii și a dezvoltării79.
Larvele de țânțari Ae. Aedes aegypti au fost expuse continuu la pulbere de semințe de Brassica timp de 24-72 de ore. (A) Larve moarte cu particule de făină de semințe în aparatul bucal (încercuite); (B) Tratamentul de control (dH20 fără adaos de făină de semințe) arată că larvele cresc normal și încep să pupeze după 72 de ore. (C, D) Larve tratate cu făină de semințe; făina de semințe a prezentat diferențe de dezvoltare și nu a pupat.
Nu am studiat mecanismul efectelor toxice ale izotiocianaților asupra larvelor de țânțari. Cu toate acestea, studiile anterioare efectuate pe furnicile roșii de foc (Solenopsis invicta) au arătat că inhibarea glutation S-transferazei (GST) și esterazei (EST) este principalul mecanism al bioactivității izotiocianatului, iar AITC, chiar și la activitate scăzută, poate inhiba și activitatea GST. furnicile roșii de foc importate în concentrații scăzute. Doza este de 0,5 µg/ml80. În schimb, AITC inhibă acetilcolinesteraza la gărgărițele adulte ale porumbului (Sitophilus zeamais)81. Studii similare trebuie efectuate pentru a elucida mecanismul activității izotiocianatului la larvele de țânțari.
Folosim tratamentul cu DFP inactivat termic pentru a susține propunerea conform căreia hidroliza glucozinolaților vegetali pentru a forma izotiocianați reactivi servește ca mecanism de control al larvelor de țânțari prin intermediul făinii de semințe de muștar. Făina de semințe DFP-HT nu a fost toxică la dozele de aplicare testate. Lafarga și colab. 82 au raportat că glucozinolații sunt sensibili la degradare la temperaturi ridicate. De asemenea, se așteaptă ca tratamentul termic să denatureze enzima mirozinază din făina de semințe și să prevină hidroliza glucozinolaților pentru a forma izotiocianați reactivi. Acest lucru a fost confirmat și de Okunade și colab. 75 care au arătat că mirozinaza este sensibilă la temperatură, arătând că activitatea mirozinazei a fost complet inactivată atunci când semințele de muștar, muștar negru și sanguinolentă au fost expuse la temperaturi peste 80°C. Aceste mecanisme pot duce la pierderea activității insecticide a făinii de semințe DFP tratate termic.
Prin urmare, făina din semințe de muștar și cei trei izotiocianați principali ai săi sunt toxici pentru larvele de țânțari. Având în vedere aceste diferențe dintre făina din semințe și tratamentele chimice, utilizarea făinii din semințe poate fi o metodă eficientă de control al țânțarilor. Este nevoie să se identifice formulări adecvate și sisteme eficiente de administrare pentru a îmbunătăți eficacitatea și stabilitatea utilizării pulberilor de semințe. Rezultatele noastre indică utilizarea potențială a făinii din semințe de muștar ca alternativă la pesticidele sintetice. Această tehnologie ar putea deveni un instrument inovator pentru controlul vectorilor de țânțari. Deoarece larvele de țânțari prosperă în medii acvatice, iar glucozinolații din făina din semințe sunt convertiți enzimatic în izotiocianați activi după hidratare, utilizarea făinii din semințe de muștar în apa infestată cu țânțari oferă un potențial semnificativ de control. Deși activitatea larvicidă a izotiocianaților variază (BITC > AITC > 4-HBITC), sunt necesare mai multe cercetări pentru a determina dacă combinarea făinii din semințe cu mai mulți glucozinolați crește sinergic toxicitatea. Acesta este primul studiu care demonstrează efectele insecticide ale făinii din semințe de crucifere degresate și a trei izotiocianați bioactivi asupra țânțarilor. Rezultatele acestui studiu deschid noi perspective, demonstrând că făina de semințe de varză degresată, un produs secundar al extracției uleiului din semințe, poate servi ca un agent larvicid promițător pentru controlul țânțarilor. Aceste informații pot ajuta la descoperirea unor agenți de biocontrol pentru plante și la dezvoltarea lor ca biopesticide ieftine, practice și ecologice.
Seturile de date generate pentru acest studiu și analizele rezultate sunt disponibile la autorul corespondent la cerere rezonabilă. La sfârșitul studiului, toate materialele utilizate în studiu (insecte și făină de semințe) au fost distruse.
Data publicării: 29 iulie 2024